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lili1130

[交流] 关于PCR问题求助

为什么做PCR时,用的是同一种CDNA模板,同样的引物,同样的反应程序,同样反应体系,之前能PCR出目的片段,现在老是一无所获?
很着急,大家能给点建议吗?
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zjwang

木虫 (正式写手)


lili1130(金币+1,VIP+0): 9-7 08:25
cDNA降解?
2楼2009-09-05 15:27:01
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jack6335

铁杆木虫 (正式写手)


lili1130(金币+1,VIP+0): 9-7 08:25
我遇到过,估计你的引物被污染了,重新合成引物试试。
砖石王老三!!!
3楼2009-09-05 17:17:30
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jack6335

铁杆木虫 (正式写手)


lili1130(金币+1,VIP+0): 9-7 08:25
我遇到过,估计你的引物被污染了,重新合成引物试试。
砖石王老三!!!
4楼2009-09-05 17:17:51
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gastrodia

金虫 (正式写手)

★ ★
lili1130(金币+2,VIP+0): 9-5 18:35
cDNA之制备后最好赶快用掉,在-20冰箱存放一般不要超过一个月,引物反复冻融或存放时间太长也会出现问题,建议你用此模板,使用其他的引物如18sRNA看看能否扩出条带,如果不行,那就是模板不行,如果可以那就换引物,当然还有可能是你的酶出问题了,换个酶试试,想知道结果就一步步排查,做几个重复,把酶,缓冲液,模板,引物,PCR水都换一遍,每个重复只换其中一个,然后在同样的反应程序,同样反应体系进行扩增,就可以找出问题之所在
5楼2009-09-05 17:44:09
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changes

木虫 (正式写手)


lili1130(金币+1,VIP+0): 9-7 08:25
引用回帖:
Originally posted by lili1130 at 2009-9-5 15:17:
为什么做PCR时,用的是同一种CDNA模板,同样的引物,同样的反应程序,同样反应体系,之前能PCR出目的片段,现在老是一无所获?
很着急,大家能给点建议吗?

最好能具体点,有图片吗?
若是检测时点样空下面什么也没有的话?建议换PCR扩增的所有药剂(buffer、dNTPs、Taq、水、引物)。
若是有条带但是弥散或是非目的条带,建议调整下Tm值、模板量。
6楼2009-09-05 20:40:44
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tingdandan

铁虫 (初入文坛)

可能是引物污染了,我做的也是这样,重新换引物
7楼2009-09-08 13:44:25
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nql_sdau

银虫 (小有名气)

引物污染!我原来引物都不分装!这种状况是经常出现啊!!!
8楼2009-09-08 13:54:20
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bclz

铁杆木虫 (正式写手)

是啊,楼上说的对,肯定是引物污染了,建议重新合成引物
9楼2009-09-08 14:45:46
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zuodongyun

铁杆木虫 (正式写手)

我也遇到过这样的情况,不过变换一下退火温度又出来了,目前还不知道是什么原因,你可以试试
10楼2009-09-08 17:13:22
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