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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » Gibson克隆总是失败
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3110570

新虫 (初入文坛)

[求助] Gibson克隆总是失败 已有1人参与

1个载体连3个片段，都是用pcr方式扩增，能扩出正确条带，回收后还对载体DpnI酶切处理了，加入seamless混合酶50℃反应半小时到50分钟左右，转化涂板能长满板，可就是用验证引物菌P验证没一个有条带的，思来想去查了很多就是不知道问题出在哪里了。请求各路大神帮忙解答一下，谢谢了！

@youlinglyw 发自小木虫IOS客户端
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1楼 2022-03-14 15:10:23
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OLBioLab

新虫 (初入文坛)
可以尝试先用重叠PCR把三个片段连成一个，克隆到T栽，再连接到载体

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2楼2022-03-16 06:55:24
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澜沧的爱

新虫 (小有名气)
建议检查一下片段，以及同源区域长度和温度

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3楼2022-03-16 10:51:35
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shuaibia6

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
不同片段之间还有片段和载体之间重叠部分有没有设计好
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4楼2022-03-16 13:24:44
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