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[交流]
常用蛋白表达系统
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引言 通常，难以从天然来源直接获得高质量的特定蛋白，尤其是人体蛋白。很多研究者通过将基因克隆至可在易培养细胞中操作的人工载体上，通过异源表达来克服这个问题，这些细胞包括大肠杆菌、毕赤（酵母）及一系列的昆虫细胞和哺乳动物细胞。 大肠杆菌表达系统 是应用最广泛的蛋白表达系统之一，市面上的重组蛋白有30%是由大肠杆菌表达系统生产而来，是小分子细胞质蛋白或结构域表达的首选宿主。在大肠杆菌表达系统中表达的外源基因包括原核基因和真核基因；原核基因可以直接在大肠杆菌中表达出来，真核基因含有内含子，大肠杆菌不能对mRNA进行剪切形成成熟的mRNA，因此，真核基因一般以cDNA构建表达载体在大肠杆菌系统中表达。 优势： 表达背景清楚、表达水平高、宿主菌繁殖快、培养简单、价格便宜、标签多 样、蛋白表达量大。 劣势： 没有真核生物的翻译后修饰、大蛋白可能不能正常折叠、一些蛋白可能对宿主有毒性、包涵体复性难。 质粒：Pet系列、pGEx系列、MBP（麦芽糖系统） 菌株：BL21、Rosetta等 标签：His、GST、MBP、SUMO、FLAG、GFP、HA等 主要应用：制备抗原、蛋白酶活性检测、蛋白互作（Co-IP、Pull-down等）、蛋白晶体研究、生化实验等。 酵母系统 自1979年，为了克服大肠杆菌表达系统的缺点，延伸了酵母表达系统。酵母表达系统兼有原核和高等真核系统的优点。与其他表达系统的基因存在于游离质粒上不同，它的表达质粒是通过同源重组整合在基因组上的，转化简单（不需要病毒原液），表达菌株可以长时间保持（大于10年）而不失活。 优势： 使用简单、表达量高、可大规模生产、相对低廉的价格、有很多真核的翻译后修饰和加工、大蛋白能较好地折叠。 劣势： 培养时间相较于细菌较长、标签较少、不能进行复杂的翻译后修饰。 质粒：pPIC3K、pPICZA、pPIC3.5K 菌株：X33、GS115 主要应用：适合于稳定表达有功能的外源蛋白质，而且可大规模发酵，是理想的重组真核蛋白生产制备工具。 昆虫系统 属于真核细胞表达系统，但不同于酵母和哺乳动物细胞表达系统。通过转座作用将转移载体中的表达组件定点转座到能在大肠杆菌中繁殖的杆状病毒穿梭载体上，通过抗性和蓝白斑筛选到重组穿梭质粒，提取穿梭质粒DNA转染昆虫细胞后，得到的子代病毒即为重组病毒。将病毒上清浸染昆虫细胞，获得表达的重组蛋白。 优势： 大蛋白正确折叠、具有真核翻译后修饰、毒性蛋白可被表达。 劣势： 费用较高、重组杆状病毒费时较长、需组织培养条件。 载体：pFastBAC 菌株：sf9、sf21、High-5等 主要应用：用于生产具有哺乳动物细胞末端唾液酸化修饰的N糖蛋白。 表达系统的选择 选择表达系统主要考虑蛋白质的大小、需要蛋白质的量、蛋白质来源的物种，以及蛋白质是否有二硫键和翻译后修饰。如果只需要少量目标蛋白——如当筛选一系列点突变用于酶活性研究时，不需要优化生产条件。但是，如果必须纯化一个活性蛋白和/或需要大量蛋白质时，在发现一个大规模可用方法前就需要尝试不同的宿主-载体系统、表达条件和/或纯化方案。 展望 随着药物审批上市相关激励政策不断完善和落实，加上数字化技术在中国的迅速发展，中国生物医药领域技术逐渐与世界接轨，国内外医药企业一致看好中国生物医药市场，纷纷开始扩大生物医药市场的部署与投资。重组蛋白表达系统将会随着生物技术的发展越来越成熟和多元化。 |
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