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xuhuaiqian

铁虫 (初入文坛)

[交流] 5'RACE产物弥散

本人现在做植物的5'RACE,用的是clone tech的smart kit,基因特异引物间可以扩增出目的大小的片段,说明反转录没有问题,但是特异引物和5'UPM间扩增只有弥散的带,一直没有特异片段的产生,求助各位达人是什么问题,怎么解决。
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rainbamboo8707

金虫 (小有名气)

提高退火温度 使用touchdown-pcr试试
不行的话就设计巢式引物,做nest-pcr
2楼2009-08-28 09:37:09
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xuhuaiqian

铁虫 (初入文坛)

我用的是巢式+touchdown,
第一轮68+66+64,条带弥散,第二轮58+56+54.弥散。
第一轮72+70+68,弥散,第二轮58+56+54,弥散。
直接梯度,从68到58,没有弥散条带,只有引物二聚体了。
3楼2009-08-28 09:45:12
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rainbamboo8707

金虫 (小有名气)


小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
那你的PCR是多少循环啊 ?
4楼2009-08-28 09:53:20
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xuhuaiqian

铁虫 (初入文坛)

梯度5+5+25循环
5楼2009-08-28 11:32:24
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695

木虫 (职业作家)


小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
那就不是很清楚了啊,目前我也正在进行5RACE
6楼2009-08-28 15:33:47
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十比

木虫 (著名写手)


小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
退火温度太高了, 先用很很低的温度如48 50跑几个循环,再用较高的温度跑
另外目的产物的大小不能太长。
7楼2009-08-28 16:18:34
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xuhuaiqian

铁虫 (初入文坛)

先低温的也做过了,看来最大的可能性是接头没有搞好了
8楼2009-08-29 14:59:04
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