[交流] 外泌体相关研究文献分享,轻松读完一篇文献（十四） 已有2人参与

今天分享一篇发表在Advanced Science（2021年IF=16.806）上的文章，名为《Embryonic Stem Cells-Derived Exosomes Endowed with Targeting Properties as Chemotherapeutics Delivery Vehicles for Glioblastoma Therapy》[1]（胚胎干细胞来源的外泌体具有靶向特性，可作为胶质母细胞瘤治疗的化疗药物递送载体）。 胶质母细胞瘤(GBM)是中枢神经系统最常见的原发性恶性肿瘤，死亡率和致残率均较高。除了耐药性很高，其不良预后的另一个关键原因是血脑屏障(BBB)限制了化疗药物到达肿瘤区域。因此，专门开发设计药物传递策略来克服血脑屏障是实现GBM有效治疗的迫切需求。 在以前的研究中，人们已经努力开发合成药物传递系统来透过生物屏障。然而，这些合成的纳米载体仍存在生物毒性和血脑屏障穿透能力低下等问题。外泌体是一类双层脂质细胞外囊泡，可由几乎所有类型的哺乳动物细胞分泌，粒径分布为30-100nm，通过将分子从亲本细胞运输到受体细胞来响应细胞间的通信。在天然衍生的纳米载体种，外泌体由于其低生物毒性和多种的生物功能，如免疫特性、装载物保护和最重要的生物屏障穿透能力，被认为是优秀的药物传递纳米载体。据报道，外泌体由于其特殊的表面结构，如四酯酶蛋白和整合素，而表现出内在的组织或细胞靶向特性。此外，通过工程表面分子可以获得更好的外泌体靶标能力。尽管基于外泌体的药物载体取得了进展，但还应该确定一种适合外泌体衍生的细胞类型。 人胚胎干细胞(ESCs)是一种来自囊胚内细胞团的多能干细胞，可以在体外培养中几乎无限期保持未分化。此外，它们也具有无限增殖的能力。因此，ESCs可以大规模产生具有稳定特性的外泌体(ESC-exos)，这是外泌体临床应用的重要因素。此外，ESC微环境已被证实可以抑制癌细胞的致癌表型。研究表明，恶性癌细胞在胚胎微环境中被重新编程为分化程度更高、侵袭性更低的表型。ESC-exos含有反映胚胎微环境含量的物质，这可能是ESCs介导的抗肿瘤作用的主要效应因素。此外，有研究发现ESC-exos可以将人类乳腺癌细胞重新编程为一个较低恶性的细胞表型。因此，与其他类型的细胞相比，ESCs是非常适合量产外泌体，可以在癌症治疗中开发基于外泌体的化疗载体。 然而，尽管外泌体显示出穿透血脑屏障的能力，但许多研究表明，静脉注射的外泌体主要分布在肝脏或脾脏，并且极小部分注射的外泌体保留在大脑或肿瘤部位。因此，在使用ESC-exos治疗胶质瘤之前，应该采取有效的策略来解决这个问题。用肿瘤靶向配体直接修饰外泌体表面已被证明可以有效增强外泌体的肿瘤滞留。Cyclo(Arg-Gly-Asp-D-Tyr-Lys)肽(c(RGDyK))是一种著名的癌症化疗靶向配体，与αvβ3整合素受体具有高亲和力，αvβ3整合素受体在GBM、前列腺癌和肺癌等肿瘤组织积极增殖的内皮表面过表达。这些研究表明，用c(RGDyK)修饰的纳米载体可以更有效地将化疗药物传递到癌细胞中，并能显著提高抗肿瘤效果。此外，用c(RGDyK)修饰的外泌体具有较强的穿过血脑屏障的能力。然而，用c(RGDyK)修饰的ESC-exos是否能增强ESC-exos在胶质瘤部位的分布，并提高胶质瘤的治疗效率，目前尚不清楚。 基于上述陈述，本研究开发了一种通过c(RGDyk)肽修饰ESC-exos的肿瘤靶向肿瘤(cRGD-ESC-exos)传递系统，用于胶质瘤治疗，希望通过结合ESC-exos的先进特性和靶向配体，可以开发出一种有效的基于外泌体的策略，用于胶质瘤的治疗，我们的工作也可以促进ESC-exos在药物传递中的应用。 研究过程： 一、ESCs和ESC-Exos的表征 在Matrigel上培养的ESCs形成了一个紧密的尖锐边缘菌落(图1a)。免疫染色分析显示，细胞球中所有细胞均表达碱性磷酸酶(ALP，图1b)和多能性标记分子，包括Nanog、Oct4、SSEA4、TRA1-60和TRA1-81(图1c)。培养细胞的这些特征与ESCs的特征相一致。之后，从细胞培养上清中纯化ESC-exos，并通过透射电子显微镜(TEM)、免疫印迹和纳米流式分析仪(NanoFCM)进行表征。透射电镜图像清楚地显示，ESC-exos呈圆形形态，直径约为75nm(图1d)。Western blot证实ESC-exos表达外泌体特异性标记物CD63、Alix和TSG101，不表达阴性标记物高尔基膜结合蛋白GM130(图1e)。纳米流式分析显示，平均直径为70.2±18nm(图1f)，ESC-exos的浓度约为1×10^11颗粒/mL。这些数据表明，我们已经成功地从ESCs培养基中提取和纯化了ESC-exos。 二、ESC-Exos在体外和体内均显示GBM抑制活性 为了确认ESC-exos是否具有广泛的抗癌活性，特别是对GBM，我们培养了6种癌细胞系，包括人GBM细胞系(U87和U251)、肺癌细胞系(A549)、肝细胞癌(HCC)细胞系(HepG2)、黑色素瘤细胞系(B16)、乳腺癌细胞系(MDA-MB-MB-231)和前列腺癌细胞系(DU145)，在含ESC-exos(1×10^9颗粒/mL)的培养基中培养48h。如图2a和图S1所示，细胞活力试验(CCK-8试验)显示，ESC-exos显著降低了这些癌细胞的活力。为了进一步证实ESC-exos在GBM细胞中的作用，我们使用U87和U251细胞系进行了后续实验。 为了对U87和U251细胞发挥作用，ESC-exos需要被这些细胞吸收。因此，ESC-exos用亲脂性荧光染料DiI标记，加入U87和U251细胞培养基中。孵育12h后，ESC-exos被U87和U251有效内化(图2b)。为评价细胞凋亡的影响，采用AnnexinV-PE/7-AAD标记进行流式细胞术检测ESC-exos(1×10^9颗粒/mL)处理后细胞凋亡的诱导作用。与对照组相比，ESC-exos组的凋亡细胞百分比显著增加(图2c，d)。这些数据表明，ESC-exos通过抑制细胞活力和促进细胞凋亡影响GBM细胞生长。 为了评估ESC-exos是否能够影响体内GBM的生长，我们进行了携带皮下U87GBM异种移植的无胸腺裸鼠实验。一旦肿瘤肿块生长到约200mm3（≈2周），小鼠每隔一天静脉注射磷酸盐缓冲盐水(PBS，对照组，Ctl，125?L)或ESC-exos(125?L，1×10^11颗粒/mL)，持续2周。从这些小鼠中切除的肿瘤如图2e所示，肿瘤生长曲线和肿瘤重量如图2f、g所示。在研究结束时，注射ESC-exos的小鼠的肿瘤大小(401.3±122.3mm3)明显小于注射PBS的小鼠(872.4±128.2mm3；p<0.01)。与PBS治疗组相比，ESC-exos治疗组的肿瘤体重也显著下降(1.0±0.1g VS 0.6±0.2g；p<0.05)。这些数据表明，与PBS组相比，ESC-exos组的肿瘤生长明显受到抑制。综上所述，这些数据表明ESC-exos在体内表现出抗GBM的作用。 既往研究证实了ESCs微环境的抑瘤作用。ESCs微环境可以通过降低克隆原性和致瘤性，将侵袭性癌细胞重新编程为良性表型。Nodal信号通路已被证明参与了这一过程。ESC-exos含有反映其来源细胞内容的物质，据报道可将乳腺癌细胞重新编程到良性阶段，并降低其致瘤性。ESC-exos对恶性癌细胞重新编程的机制与将其内容物转移到靶癌细胞有关。本研究应用体外和体内模型证明了ESC-exos的抗GBM特性。然而，这一现象背后的机制在本研究中并不是模糊的。根据先前的研究，可能的潜在机制可能是ESC-exos包含ESC特异性的重编程因子，这些因子可以被传递到靶向GBM细胞，随后将其恢复为良性表型。 三、cRGD-Exo-PTX的制备 许多药物跨越血脑屏障的能力较差，这极大地限制了化疗对GBM的疗效。外泌体具有跨越血脑屏障的内在能力，因此，适合克服与因其血脑屏障不通透性而无法进入临床试验的潜在药物相关的问题。ESCs可以为临床应用提供丰富的外泌体来源，ESC-Exos具有证明的显著的抗GBM作用。这些特性使ESC-exos成为一个很有前途的用于GBM治疗的药物传递载体的工具。然而，静脉注射后未经修饰的外泌体的生物分布研究显示，外泌体在肝脏和脾脏器官中快速积累，很少有外泌体被传递到大脑。因此，ESC-exos的靶向特性需要改进，才能用于提供针对GBM的治疗。已经有充分的研究表明，c(RGDyK)肽结合药物传递系统用于活性肿瘤靶向治疗。紫杉醇(PTX)是一种抑制肿瘤细胞的有丝分裂抑制剂，广泛用于实体肿瘤的治疗。虽然PTX显示出有效的抗GBM活性，但由于其低血脑屏障通透性低，不能在体内产生治疗效果。 为了获得适合于后续实验的工程ESC-exos，首先将ESC-exos与c(RGDyK)偶联，然后通过共孵育加载PTX，命名为cRGD-Exo-PTX(图3a)。通过透射电镜检测Exo-PTX(装载PTX的ESC-exos)和cRGD-Exo-PTX的形态，均显示为圆形的球形囊泡(图3b)。采用NanoFCM分析了粒径的分布范围。Exo-PTX和cRGD-Exo-PTX的平均直径分别为107±20和125.2±27nm(图3c)。这些结果表明，cRGD-Exo-PTX和Exo-PTX在cRGD修饰和载药后保持了完整性。 四、cRGD-Exo-PTX在体外和体内的靶向能力 在制备cRGD-Exo-PTX后，我们评估了cRGD-Exo-PTX的靶向能力。用DiI标记的Exo-PTX和cRGD-Exo-PTX孵育U87和U251细胞，然后在荧光显微镜下观察荧光信号。Exo-PTX和cRGD-Exo-PTX的浓度均为1×10^9个颗粒/mL。cRGD-Exo-PTX孵育的U87和U251细胞比Exo-PTX孵育的细胞信号更强(图4a)，这表明cRGD-Exo-PTX在体外具有显著的GBM细胞靶向能力。此外，我们通过原位异种移植物证实了cRGD-Exo-PTX在体内的积累能力。Exo-PTX和cRGD-Exo-PTX分别用DiR标记。然后，在原位植入1周后，将125?L DiR标记的Exo-PTX或cRGD-Exo-PTX(1×10^11颗粒/mL)静脉注射到荷瘤小鼠体内(n=3)。通过实时成像系统记录了在24和48h时的荧光信号强度。如图4b所示，cRGD-Exo-PTX处理组肿瘤区域的荧光强度明显高于exo-PTX处理组。然后收集主要器官（脑、肝、脾、肺、肾、肠），并进一步检测这些器官中的荧光信号。如图4c所示，Exo-PTX组的大脑荧光强度弱于cRGD-Exo-PTX组。相反，exo-PTX处理的小鼠的其他器官（肝、脾、肺、肾和肠）的荧光明显强于cRGD-Exo-PTX处理的小鼠。这些结果表明，cRGD-Exo-PTX比Exo-PTX更有效地在胶质瘤部位积累，证明了cRGD-Exo-PTX的肿瘤靶向能力。 五、cRGD-Exo-PTX的体外靶向治疗 在验证了cRGD-Exo-PTX的靶向能力后，我们通过Cck8和Click-iTEdU实验检测了cRGD-Exo-PTX对U87和U251细胞的抗增殖作用。U87和U251细胞与PBS(对照组，Ctl)、PTX(3.2?g/mL)、Exo-PTX(1×10^9颗粒/mL)和cRGD-Exo-PTX(1×10^9颗粒/mL)孵育48小时。结果显示，与PBS、游离PTX和Exo-PTX相比，cRGD-Exo-PTX能更有效地降低U87和U251细胞的细胞活力(图5a，b)。然后，我们评估了这些培养物中的细胞凋亡率。与PBS、PTX和Exo-PTX处理相比，cRGD-Exo-PTX处理后，U87和U251细胞的凋亡百分比显著增加(图5c)。这些结果表明，cRGD-Exo-PTX对U87和U251细胞的抑制作用强于游离的PTX和Exo-PTX，证实了cRGD-Exo-PTX在体外具有较高的抗肿瘤作用。 六、cRGD-Exo-PTX的体内靶向治疗 受这些结果的鼓舞，我们进一步观察了cRGD-Exo-PTX对皮下荷瘤小鼠的治疗作用。小鼠每隔一天经尾静脉注射PBS(对照组，Ctl，125?L)、PTX(320?g/mL；125?L)、Exo-PTX(1×10^11颗粒/mL；125?L)和cRGD-Exo-PTX(1×10^11颗粒/mL；125?L)治疗2周。如图6a、b，在研究结束时，PTX、Exo-PTX和cRGD-Exo-PTX治疗组，与PBS处理组相比显著降低了肿瘤体积(PBS组778.7±165.4mm3，PTX组567.9±138.9mm3，p<0.05；Exo-PTX组242.2±109.0mm3，p<0.01；cRGD-Exo-PTX组81.2±14.0mm3)。与PTX和Exo-PTX组相比，cRGD-Exo-PTX组肿瘤生长明显抑制(81.2±14.0mm3，cRGD-Exo-PTX组 VS 567.9±138.9mm3，PTX组，p<0.01；242.2±109.0mm3，Exo-PTX组，p<0.05)。各组患者的体重均无显著性差异（图S2）。此外，与PBS、PTX和Exo-PTX组相比，cRGD-Exo-PTX处理后Ki67阳性细胞数量显著减少，末端脱氧核苷酸转移酶dUTP末端标记(TUNEL)阳性细胞数量明显增加(图6c)。 为了评估cRGD-Exo-PTX的长期效果，我们记录了原位脑肿瘤模型的总生存率。小鼠每隔一天经尾静脉注射PBS(对照组，Ctl，125?L)、ESC-exos(1×10^11颗粒/mL；125?L)、PTX(320?g/mL；125?L)、Exo-PTX(1×10^11颗粒/mL；125?L)和cRGD-Exo-PTX(1×10^11粒子/mL；125?L)。Kaplan-Meier生存曲线显示，使用cRGD-Exo-PTX治疗的原位脑瘤小鼠的平均生存率比其他组要长得多(图6d)。这些结果表明，cRGD-Exo-PTX在体内比ESC-exos、PTX和Exo-PTX具有更强的靶向治疗能力。 总结： 综上所述，我们在体内外均证实了ESC-exos的GBM抑制作用。然后将ESC-exos与肿瘤靶向c(RGDyK)肽偶联，并加载PTX，该工程外泌体被命名为cRGD-ExoPTX，已被证明具有良好的GBM靶向能力，并提高了PTX在GBM模型中的疗效。综上所述，我们的研究设计了一种新型的GBM靶向外泌体，并为脑肿瘤的治疗提供了一个强有力的工具。 参考文献： [1]Zhu, Q; Ling, X; Yang, Y; et al.Embryonic Stem Cells-Derived Exosomes Endowed with Targeting Properties as Chemotherapeutics Delivery Vehicles for Glioblastoma Therapy.[J].Adv Sci (Weinh).2019,6(6):180189 发自小木虫Android客户端

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