应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 双酶切切不开
101/1返回列表
查看: 838  |  回复: 9
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看
当前主题已经存档。

dcb005

金虫 (著名写手)

[交流] 双酶切切不开

双酶切切不开  
做原核表达，insert DNA 插入到表达载体后，Kan筛选，之后克隆PCR检测，获得了目的条带，培养提质粒，利用此质粒做PCR，也ok，于是用双酶切检测，2次了也没有得到目的条带，不知道为什么？在insert DNA插入T载体，双酶切检测，能得到目的条带，是哪儿出毛病了呢？
回复此楼

» 猜你喜欢
★穷则独善其身,达则兼济天下★
1楼 2009-08-27 10:39:55
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

brightfuture01

木虫之王 (文坛精英)

我爱打老虎

文献杰出贡献
可能是插入片段相对于载体来片段说比较小，试着加大酶切体系中质粒的量。
赞一下 回复此楼
The world is a fine place and worth fighting for. I agree with the second part.
2楼2009-08-27 10:41:41
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

Anson1358

铁杆木虫 (著名写手)
你酶切后电泳检测质粒还能看到吗？酶切受很多因素影响的，质粒提的质量不好的话也切不开
赞一下 回复此楼
一个人可以不成功，但不可以不成长！
3楼2009-08-27 10:50:36
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

dcb005

金虫 (著名写手)
引用回帖:
Originally posted by brightfuture01 at 2009-8-27 10:41:
可能是插入片段相对于载体来片段说比较小，试着加大酶切体系中质粒的量。

加大到30ul，loading20ul ，还是没有目的条带
赞一下 回复此楼
★穷则独善其身,达则兼济天下★
4楼2009-08-27 10:50:37
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

Anson1358

铁杆木虫 (著名写手)
要是酶切后检测，原来的质粒都没有的话，你就纯化一下质粒，然后再做酶切验证。
赞一下 回复此楼
一个人可以不成功，但不可以不成长！
5楼2009-08-27 10:51:38
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

nicknelson

至尊木虫 (职业作家)
★
dcb005(金币+1,VIP+0):谢谢 8-31 16:27
1.没是否有活性？加阳性对照。
2.两种什么酶？如果是同尾酶，反向插入的话就切不开了。
赞一下 回复此楼
6楼2009-08-27 10:55:42
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

dcb005

金虫 (著名写手)
引用回帖:
Originally posted by nicknelson at 2009-8-27 10:55:
1.没是否有活性？加阳性对照。
2.两种什么酶？如果是同尾酶，反向插入的话就切不开了。

酶肯定有，切T载体+gene 时ok，是xba1+nhe ，M buffer，Takara 公司的
，很头疼啊，不存在同尾现象
赞一下 回复此楼
★穷则独善其身,达则兼济天下★
7楼2009-08-27 13:35:33
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

nicknelson

至尊木虫 (职业作家)
那就测序吧，心里有底。
赞一下 回复此楼
8楼2009-08-27 15:37:07
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

nicknelson

至尊木虫 (职业作家)
★ ★ ★ ★ ★
dcb005(金币+5,VIP+0):很不错的回答 8-28 08:43
Xba1和Nhe1都产生CTAG的粘性末端，是同尾酶，可以反向插入，反向插入的话酶切位点的序列就变了，不是任何一个酶切位点序列，所以就切不开了。能切开的才是正向插入的。这种情况阳性率很低的，因为相当于单酶切，载体很容易自连。
赞一下(1人) 回复此楼
9楼2009-08-27 15:46:22
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

nicknelson

至尊木虫 (职业作家)
是Nhe1吧？好像没有Nhe
赞一下 回复此楼
10楼2009-08-27 15:47:18
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 dcb005 的主题更新
101/1返回列表
普通表情 龙 兔 虎 猫 高级回复 (可上传附件)
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[基金申请] 欢迎发来filecode的Mz6后的代码验证其规律 +31 医学老男孩 2026-08-13 69/3450 2026-08-16 00:16 by mo_mo_mo_mo
[基金申请] 有时候，自然基金真的不能太认真 （我的申报经验） +9 majunge000 2026-08-11 11/550 2026-08-15 23:20 by botar
[基金申请] filecode=后面第一个是大写字母 +6 wangze12014 2026-08-14 7/350 2026-08-15 20:12 by gltch
[基金申请] filecode +8 cratir 2026-08-14 12/600 2026-08-15 18:08 by zyfgau
[基金申请] 哪位老哥知道今年的国自然具体哪一天放榜？ +7 Ldrop2023 2026-08-13 7/350 2026-08-15 15:57 by mzhh2000
[基金申请] 各位道友，我要去昆明玩几天，回来见。 +7 Tide man 2026-08-14 8/400 2026-08-15 01:11 by arzu_hma
[基金申请] 咱们一起用铁证分析2026国家社科基金中标与否 +7 启萌科技 2026-08-12 22/1100 2026-08-14 23:45 by Noways
[基金申请] 应该是93bebmhtak前后十一个字符比较关键 +23 Lanmanbaby 2026-08-09 37/1850 2026-08-14 13:40 by Equinoxhua
[硕博家园] 请教兼职经验 +3 是阿文鸭 2026-08-09 3/150 2026-08-14 12:07 by HER12025
[基金申请] filecode +15 documentary 2026-08-10 17/850 2026-08-14 10:08 by kissu88
[基金申请] 静等基金结果 +8 gjjjzhong 2026-08-10 21/1050 2026-08-13 17:56 by 且听虎啸
[基金申请] Filecode 又变了，巨变 +3 WH3796 2026-08-12 4/200 2026-08-13 14:13 by 小木虫6752397
[基金申请] 分享一下我之前已中青C的计划书的filecode +4 布布和一二 2026-08-11 5/250 2026-08-13 12:56 by cratir
[基金申请] 结合人工智能，周易传统文化，filecode打分制来了，3分以上希望很大。 +3 Tide man 2026-08-12 4/200 2026-08-13 08:35 by ZJTJZ
[基金申请] 2019年青年基金涵评意见，大家看看几个A，几个B? +11 Tide man 2026-08-11 11/550 2026-08-13 07:35 by 撸猫猫
[基金申请] 综述论文作为代表作会不会影响评审专家的印象分？ +11 yufeiwaner 2026-08-09 13/650 2026-08-12 08:17 by yufeiwaner
[基金申请] 帮忙看看fileCode +7 wwncly 2026-08-10 13/650 2026-08-11 19:36 by 冰心玉壶晴
[基金申请] 确定了，国自然21号放榜 +6 布布和一二 2026-08-10 7/350 2026-08-10 19:15 by 2000zf36392
[基金申请] 国自然结果 +4 Vierhys 2026-08-10 8/400 2026-08-10 15:06 by Vierhys
[基金申请] 面上项目filecode邪修 +5 西山十月 2026-08-09 7/350 2026-08-10 07:32 by 仁砚薪传
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭