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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 双酶切切不开
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dcb005

金虫 (著名写手)

[交流] 双酶切切不开

双酶切切不开  
做原核表达，insert DNA 插入到表达载体后，Kan筛选，之后克隆PCR检测，获得了目的条带，培养提质粒，利用此质粒做PCR，也ok，于是用双酶切检测，2次了也没有得到目的条带，不知道为什么？在insert DNA插入T载体，双酶切检测，能得到目的条带，是哪儿出毛病了呢？
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★穷则独善其身,达则兼济天下★
1楼 2009-08-27 10:39:55
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brightfuture01

木虫之王 (文坛精英)

我爱打老虎

文献杰出贡献
可能是插入片段相对于载体来片段说比较小，试着加大酶切体系中质粒的量。
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The world is a fine place and worth fighting for. I agree with the second part.
2楼2009-08-27 10:41:41
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Anson1358

铁杆木虫 (著名写手)
你酶切后电泳检测质粒还能看到吗？酶切受很多因素影响的，质粒提的质量不好的话也切不开
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一个人可以不成功，但不可以不成长！
3楼2009-08-27 10:50:36
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dcb005

金虫 (著名写手)
引用回帖:
Originally posted by brightfuture01 at 2009-8-27 10:41:
可能是插入片段相对于载体来片段说比较小，试着加大酶切体系中质粒的量。

加大到30ul，loading20ul ，还是没有目的条带
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★穷则独善其身,达则兼济天下★
4楼2009-08-27 10:50:37
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Anson1358

铁杆木虫 (著名写手)
要是酶切后检测，原来的质粒都没有的话，你就纯化一下质粒，然后再做酶切验证。
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一个人可以不成功，但不可以不成长！
5楼2009-08-27 10:51:38
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nicknelson

至尊木虫 (职业作家)
★
dcb005(金币+1,VIP+0):谢谢 8-31 16:27
1.没是否有活性？加阳性对照。
2.两种什么酶？如果是同尾酶，反向插入的话就切不开了。
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6楼2009-08-27 10:55:42
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dcb005

金虫 (著名写手)
引用回帖:
Originally posted by nicknelson at 2009-8-27 10:55:
1.没是否有活性？加阳性对照。
2.两种什么酶？如果是同尾酶，反向插入的话就切不开了。

酶肯定有，切T载体+gene 时ok，是xba1+nhe ，M buffer，Takara 公司的
，很头疼啊，不存在同尾现象
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★穷则独善其身,达则兼济天下★
7楼2009-08-27 13:35:33
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nicknelson

至尊木虫 (职业作家)
那就测序吧，心里有底。
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8楼2009-08-27 15:37:07
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nicknelson

至尊木虫 (职业作家)
★ ★ ★ ★ ★
dcb005(金币+5,VIP+0):很不错的回答 8-28 08:43
Xba1和Nhe1都产生CTAG的粘性末端，是同尾酶，可以反向插入，反向插入的话酶切位点的序列就变了，不是任何一个酶切位点序列，所以就切不开了。能切开的才是正向插入的。这种情况阳性率很低的，因为相当于单酶切，载体很容易自连。
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9楼2009-08-27 15:46:22
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nicknelson

至尊木虫 (职业作家)
是Nhe1吧？好像没有Nhe
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10楼2009-08-27 15:47:18
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