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dcb005

金虫 (著名写手)

[交流] 双酶切切不开

双酶切切不开  
做原核表达,insert DNA 插入到表达载体后,Kan筛选,之后克隆PCR检测,获得了目的条带,培养提质粒,利用此质粒做PCR,也ok,于是用双酶切检测,2次了也没有得到目的条带,不知道为什么?在insert DNA插入T载体,双酶切检测,能得到目的条带,是哪儿出毛病了呢?
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brightfuture01

木虫之王 (文坛精英)

我爱打老虎

文献杰出贡献

可能是插入片段相对于载体来片段说比较小,试着加大酶切体系中质粒的量。
The world is a fine place and worth fighting for. I agree with the second part.
2楼2009-08-27 10:41:41
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Anson1358

铁杆木虫 (著名写手)

你酶切后电泳检测质粒还能看到吗?酶切受很多因素影响的,质粒提的质量不好的话也切不开
一个人可以不成功,但不可以不成长!
3楼2009-08-27 10:50:36
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dcb005

金虫 (著名写手)

引用回帖:
Originally posted by brightfuture01 at 2009-8-27 10:41:
可能是插入片段相对于载体来片段说比较小,试着加大酶切体系中质粒的量。

加大到30ul,loading20ul ,还是没有目的条带
★穷则独善其身,达则兼济天下★
4楼2009-08-27 10:50:37
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Anson1358

铁杆木虫 (著名写手)

要是酶切后检测,原来的质粒都没有的话,你就纯化一下质粒,然后再做酶切验证。
一个人可以不成功,但不可以不成长!
5楼2009-08-27 10:51:38
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nicknelson

至尊木虫 (职业作家)


dcb005(金币+1,VIP+0):谢谢 8-31 16:27
1.没是否有活性?加阳性对照。
2.两种什么酶?如果是同尾酶,反向插入的话就切不开了。
6楼2009-08-27 10:55:42
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dcb005

金虫 (著名写手)

引用回帖:
Originally posted by nicknelson at 2009-8-27 10:55:
1.没是否有活性?加阳性对照。
2.两种什么酶?如果是同尾酶,反向插入的话就切不开了。

酶肯定有,切T载体+gene 时ok,是xba1+nhe ,M buffer,Takara 公司的
,很头疼啊,不存在同尾现象
★穷则独善其身,达则兼济天下★
7楼2009-08-27 13:35:33
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nicknelson

至尊木虫 (职业作家)

那就测序吧,心里有底。
8楼2009-08-27 15:37:07
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nicknelson

至尊木虫 (职业作家)

★ ★ ★ ★ ★
dcb005(金币+5,VIP+0):很不错的回答 8-28 08:43
Xba1和Nhe1都产生CTAG的粘性末端,是同尾酶,可以反向插入,反向插入的话酶切位点的序列就变了,不是任何一个酶切位点序列,所以就切不开了。能切开的才是正向插入的。这种情况阳性率很低的,因为相当于单酶切,载体很容易自连。
9楼2009-08-27 15:46:22
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nicknelson

至尊木虫 (职业作家)

是Nhe1吧?好像没有Nhe
10楼2009-08-27 15:47:18
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