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慧啊！新虫 (正式写手)
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荧光光谱有多个峰，为什么 已有1人参与
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测得的荧光光谱，虽然是有一个大的明显的峰，但是这个峰有许多不规整的小峰，为什么会这样啊？不是平滑的曲线 难道是因为物质不纯？我做的是碳点，也没有纯不纯这一说法啊@Monash2011 |
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【答案】应助回帖
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较为理想的熔解曲线是单峰曲线，如出现多峰有以下原因： 1）非特异性扩增：主要原因为引物特异性不好、Tm值较低或模板质量不高，可以根据设计原则设计新引物或者通过梯度 PCR 对引物退火温度（Tm值）进行优化，上调Tm值，选购质量较好的离心柱法核酸提取试剂，提高核酸提取质量，等等。 2）引物二聚体 可通过琼脂糖凝胶电泳确认引物二聚体。引物二聚体在凝胶的底部形成扩散条带，通常位于100 bp以下。引物二聚体在熔解曲线内峰值一般位于75℃左右，如该峰显著请按照以下方面进行优化： A.优化扩增条件，如提高退火温度，可利用梯度PCR，摸索最佳的Tm值。通常两步循环(由 95℃变性步骤直接进入 60℃退火和延伸步骤) 有利于强效扩增，因此引物设计时设定的成功退火温度为 60℃。 B.引物浓度太高，适当降低引物浓度。通常引物的Tm低于目的基因，熔解曲线上峰值在目的基因峰的左边。大多数情况下，每条引物的理想最终浓度为200 nM，但如有需要，可将浓度降至60nM。 C.cDNA模板带有基因组DNA污染：重新制备cDNA模板。在RNA提取完成后加入DNase对RNA进行处理，然后逆转录为cDNA。 如果排除以上原因还是出现熔解曲线多峰的情况，就要考虑及时更换试剂盒，避免耽误实验进度。 |
5楼2023-07-23 17:41:36