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[交流]
黄嘌呤氧化酶抑制实验-体外降高尿酸实验
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我做了一个体外降高尿酸实验，用了2种实验方法： 1.XOD 抑制活性测试 反应体系体积为 200 μL，依次向 96 孔板中加入样品 40 μL， 20 U/L 的 XOD 溶液 80 μL，在恒温培养箱内 40℃ 孵育 30 min，之后加入 500 μmol/L 底物黄嘌 呤溶液 80 μL，放入 40℃ 恒温培养箱中孵育 15 min，然后在 292 nm 处记录吸光 度值。实验分别设置有样品组（含样品、酶及底物）、空白组（含底物和样品， 不含酶）、阳性对照组（含别嘌呤醇、酶及底物）、酶组（含酶和底物，不加样品）， 各个组均含 3 个复孔，实验重复三次，各样品终浓度为 100 μg/ m L，XOD 抑制 率计算公式为：抑制率（%）=[1-（样品 OD 值-空白 OD 值）/（酶 OD 值-空白 OD 值）]×100%。 这个方法获得实验数据抑制率（%）大于100%。样品与阳性药物的抑制率在高浓度下大于100% 2 NBT法 空白组XOD活性的测定:吸取50mmol·L－1磷酸缓冲液3mL加入至10mL容量瓶中，加入3mL黄嘌呤溶液(2.0mmol·L－1)和0.4mL氯化硝基四氮唑蓝(NBT，1.8mg·L－1)，摇匀，即得XOD活性测定空白溶液。向该空白溶液中加入2.5mL黄嘌呤氧化酶溶液(0.08U·mL－1)，摇匀，得到XOD活性测定溶液，以酶加入时间开始计时，于25℃反应30min后采用752型紫外光栅分光光度计测其560nm下的吸光度值(A0)。样品对XOD抑制活性测定:精密吸取阳性对照药别嘌呤醇(allopurinol)、样品溶液0.5mL，分别置于10mL容量瓶中，按空白组的操作分别加入缓冲液、黄嘌呤溶液和NBT，以酶加入时间开始计时，相同反应条件下，测得各样品的吸光度值(Ax)，根据公式:抑制率(%)=(A0－Ax)/A0×100%计算各化合物对XOD的抑制率。 这种方法存在的问题：不同浓度样品与阳性对照的抑制率不存在梯度，而且抑制率很接近。且阳性药物（别嘌呤醇）在12.5μM的浓度下抑制率只有20%。2种都是相同样品进行测试，得到的抑制率也都不一样。 想请教群里朋友们在做体外XOD 抑制活性测试的时候是否有遇到我一样的情况？ |
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