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chengjie392

[交流] 蛋白纯化

我在大肠杆菌诱导表达了一种C端融合了6-HIS的标签蛋白,经DNA测序序列完全正确,酶溶解性很高,初步测活性也很高,但在纯化过程中总是结合不上亲和柱 ,我想请教,除了做标签单抗western检测标签的正确之外,还有什么原因可以造成蛋白质与柱子不结合,怎样去检测,谢谢大家了

[ Last edited by amisking on 2009-8-22 at 08:20 ]
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l_inhumain

金虫 (小有名气)


小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
可能是标签折叠时包到到里面了,同常用尿素接折叠使标签显露出来再上柱
2楼2009-08-21 16:35:32
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chengjie392

用尿素变性后也没能结合上柱子,心情急躁啊
3楼2009-08-21 16:43:35
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paulajjh

木虫 (著名写手)

★ ★ ★
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amisking(金币+2,VIP+0):欢迎发帖交流! 8-21 17:50
我之前实验也遇到类似的情况,但我是C端和N端都加了his-tag试的,C端加了的可以纯化,但N端就不行。有可能就是折叠到内部了,你查查蛋白结构,如果不行重新构建重新表达纯化,或者采用常规纯化方法。
4楼2009-08-21 17:31:07
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snoopyzxx

木虫 (著名写手)

你的纯化条件是什么?
VX:19192310212;公众号:生物技术与IVD
5楼2009-08-21 18:42:26
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zhuangyong

新虫 (初入文坛)

是否是亲和柱的粘度过低,以致无法凝聚
6楼2009-08-21 20:03:03
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jy010422

禁虫 (正式写手)

本帖内容被屏蔽

7楼2009-08-22 02:58:46
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missu

金虫 (小有名气)


小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
你的蛋白是怎么表达的?
上柱前是否对菌进行了超声裂解?
如果有的话,可能你超声的时候使用的条件不正确,造成标签或者蛋白断裂
这样就挂不上了
8楼2009-08-22 11:19:29
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chengjie392

谢谢大家了,我用超声波和冻融法都破碎过细胞后进行纯化了,但是都是不挂柱子,现在我正在重新克隆表达,希望一切能顺利吧,大家都顺利
9楼2009-08-23 21:11:24
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