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l_inhumain金虫 (小有名气)
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关于连接的问题
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在做实验时，把同一个基因连到不同载体上，酶切都一样，但有的载体很容易就连上并且验证正确，而有的载体却怎么连都连不对，到底有哪些原因呢？大家有没有这种状况？请大家指教不甚感激啊！ [ Last edited by amisking on 2009-8-19 at 20:10 ] |
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与载体自身的大小，以及载体与目的基因大小的比值都有关系。载体与目的基因的比例更为重要，比例合适时连接效率较高。普通的化学转染对效率的要求较为严格，电转的话对这方面的要求会小一些。 建议转不出来的载体，采用粘性末端退火，即将载体和克隆片断以10：1~3：1（根据前一段介绍的特异性而定，但一般这个比例范围是适用的）的比例于55度水浴加热5~10 min，然后冰上放置5 min ，最后加入buffer和连接酶 .12~16 度过夜连接，或4 度连接40 小时。 |
6楼2009-08-19 21:31:53
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