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xueryuan

新虫 (初入文坛)

[求助] 低温诱导目的蛋白较少，高温诱导目的蛋白在沉淀中 已有1人参与

分子量为84.5kDa，载体为pET-28a，宿主为BL21，已经尝试过表达优化，低温诱导情况下提高iptg浓度以及延长诱导时间，但上清中的目的蛋白都较少，25度开始表达目的蛋白就在沉淀中，求大佬们支招下一步该怎么办

低温诱导目的蛋白较少，高温诱导目的蛋白在沉淀中


低温诱导目的蛋白较少，高温诱导目的蛋白在沉淀中-1


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1楼 2021-08-12 10:07:29
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pennchem

专家顾问 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
温度再低一些，18°C@16小时，如果不行，换ArcticExpress宿主菌，降到10°C，12°C

这样的表达量不算低了
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行至水穷处，坐看云起时
2楼2021-08-14 10:43:26
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xueryuan

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by pennchem at 2021-08-14 10:43:26
温度再低一些，18°C@16小时，如果不行，换ArcticExpress宿主菌，降到10°C，12°C

这样的表达量不算低了

谢谢您的回答试过十五度但是上清中目的蛋白量与高温对比差不多，是否可以考虑目的蛋白主要为包涵体的形式存在考虑对包涵体做出相应处理呢

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3楼2021-08-15 11:22:09
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pennchem

专家顾问 (正式写手)

【答案】应助回帖

（1）可以尝试ArcticExpress温度可以低至6-8°C，
（2）或可以尝试含GroEL的辅助表达菌种参与表达
（3）如果蛋白细胞毒性大，可以考虑分泌到细胞周质或培养基中
（4）或加入MBP，GST或其他助溶标签
（5）用体外TnT表达后纯化，成本会高一些
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行至水穷处，坐看云起时
4楼2021-08-15 13:40:18
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叶子Arger

新虫 (正式写手)
不知道你有没有考虑过目的蛋白不是分泌蛋白的问题，绝大部分蛋白在沉淀中可能是与细胞膜结合导致的，可以往这一方面考虑一下。

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5楼2021-08-16 17:33:28
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