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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 大家帮我看看问题出在哪？质粒转化问题
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goonhetty

木虫 (小有名气)

[交流] 大家帮我看看问题出在哪？质粒转化问题

同一批感受态BL21同时转化空载体和带有目的片段的载体，结果空载体没有转化进去，而带有目的片段的载体转化的板子长的非常好。可以肯定感受态没有问题。空载体以前转化过DH5a，转化成功了。现在问题不知道出在哪里，都转化了三次了，不断改变空载体浓度还是没有转化进去！有遇到过这种情况的朋友吗？大家帮我分析一下！

[ Last edited by amisking on 2009-8-16 at 13:51 ]
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1楼 2009-08-16 12:25:32
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三磷酸腺苷

铁杆木虫 (职业作家)
★ ★ ★
amisking(金币+2,VIP+0):欢迎发帖交流|！ 8-16 13:13
goonhetty(金币+1,VIP+0): 8-18 12:28
断成线状的？
因为带目的基因的那种会加连接酶……

无责任猜测，要不你就试试空载体加连接酶处理了再转化试试
当然你可以完全无视而直接重新抽质粒算了……
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2楼2009-08-16 13:05:44
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goonhetty

木虫 (小有名气)
当然不是断成线状的，是完整的空质粒。我现在只有怀疑转化时质粒浓度了，有朋友式因为质粒浓度过高而转化不成功的吗？
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3楼2009-08-16 14:33:39
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yixuanwin

铁杆木虫 (正式写手)
★
goonhetty(金币+1,VIP+0): 8-18 12:28
无责任猜想：   载体有问题？  空载体自连？   换一批试试。。。。或者感受态其实是有问题的。
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4楼2009-08-16 14:58:22
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houjinglhy

荣誉版主 (文坛精英)

表达自由，人权之基。

优秀版主
★ ★
司马诸葛(金币+1,VIP+0):谢谢交流 8-16 15:36
goonhetty(金币+1,VIP+0): 8-18 12:28
楼主所谓的空载体是酶切过的吗？ 还是就是完整的双螺旋质粒？
但两者似乎都不可能出现楼主的所说的情况！
而空载体一般式用来做对照的，
楼主既然带目的片段的转进去了，还管空载体干嘛/?
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从小就学习鲁迅，直到现在才体会到他当时是多么的绝望和无助，却仍要用尽最后一丝力气声嘶力竭的呐喊！
5楼2009-08-16 15:09:28
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goonhetty

木虫 (小有名气)
空载体就是指的是完整的双螺旋质粒，用来为表达做对照。
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6楼2009-08-16 15:34:25
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goonhetty

木虫 (小有名气)
现在可以肯定感受态没有问题，因为带有目的片段的质粒成功转化进去了!
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7楼2009-08-16 15:36:41
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jimmy7633

木虫 (著名写手)
★
goonhetty(金币+1,VIP+0): 8-18 12:28
带有目的片段的质粒验证过没？空质粒做个浓度梯度，1倍，10倍，100倍，多涂几个般再试试。
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8楼2009-08-16 15:40:16
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houjinglhy

荣誉版主 (文坛精英)

表达自由，人权之基。

优秀版主
★
goonhetty(金币+1,VIP+0): 8-18 12:28
引用回帖:
Originally posted by goonhetty at 2009-8-16 15:34:
空载体就是指的是完整的双螺旋质粒，用来为表达做对照。

表面看似乎不可能！不可能转化子的转化效率比阳性还高！
如果楼主的空载体质粒质量可以保证的话，
除了操作差异外，不可能出现这种情况。
难道是目的片段带进去了具有空载体不具有，
而此基因表达的蛋白又是筛选所必须的？
（比如目的基因是某种抗性基因，平板就是带此抗性的）。
其他想不出！
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9楼2009-08-16 15:56:35
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goonhetty

木虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by jimmy7633 at 2009-8-16 15:40:
带有目的片段的质粒验证过没？空质粒做个浓度梯度，1倍，10倍，100倍，多涂几个般再试试。

带有目的片段的质粒已经验证过没问题。你说的浓度梯度指的是稀释倍数？
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10楼2009-08-16 16:26:43
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