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a83875785铁杆木虫 (著名写手)
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SRB测定和MTT法的问题
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| 最近提取出来一些单体和混合物，老板让做SRB测定和MTT法测定实验，可是本人是天药专业的，本人或者本实验室从来没有此类实验的经验，也不知道该怎么做，想请问各位大侠们：SRB反应或者MTT实验怎么做，或者哪本书上有介绍这2种实验的做法，不甚感激！ |
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 细胞培养 |
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9楼2009-08-21 14:14:19
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karl2100(金币+1,VIP+0):多谢提供！ 8-22 22:11
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药物MTT法实验步骤 （1）贴壁细胞： 1: 收集对数期细胞，调整细胞悬液浓度，每孔加入100ul,铺板使待测细胞调密度1000- 10000 /孔，（细胞浓度的问题见后面的注意事项）。 2: 5%CO2，37℃孵育，至细胞单层铺满孔底（96孔平底板）,加入浓度梯度的药物,原则上，细胞贴壁后即可加药，或两小时，或半天时间，但我们常在前一天下午铺板，次日上午）加药.一般5-7个梯度,每孔100ul,设3-5个复孔.建议设5个，否则难以反应真实情况 3: 5%CO2，37℃孵育16-48小时，倒置显微镜下观察。 4: 每孔加入10ulMTT溶液（5mg/ml，即0.5%MTT），继续培养4h。若药物与MTT能够反应，可先离心后弃去培养液，小心用PBS冲2-3遍后，再加入含MTT的培养液。 5: 终止培养，小心吸去孔内培养液。 6: 每孔加入100ul二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10min，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪OD490nm处测量各孔的吸光值。 7: 同时设置调零孔（培养基、MTT、二甲基亚砜），对照孔（细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、MTT、二甲基亚砜）。 （2）悬浮细胞： 1: 收集对数期细胞，调节细胞悬液浓度1×106/ml（细胞浓度的问题见后面的注意事项），按次序将①补足的1640（无血清）培养基40ul ；②加Actinomycin D（有毒性）10ul用培养液稀释 (储存液100mg/ml，需预试寻找最佳稀释度，1:10-1:20)；③需检测物10ul；④细胞悬液50ul（即5×104cell/孔），共100ul加入到96孔板（边缘孔用无菌水填充）。每板设对照（加100ml 1640） 2: 置37℃，5%CO2孵育16-48小时，倒置显微镜下观察。 3: 每孔加入10 ul MTT溶液（5 mg/ml，即0.5%MTT），继续培养4 h。（悬浮细胞推荐使用WST-1，培养4 h后可跳过步骤4），直接酶联免疫检测仪OD570nm（630nm校准）测量各孔的吸光值） 4、离心（1000转x10min），小心吸掉上清，每孔加入100 ul二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10 min，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪OD570nm（630nm校准）测量各孔的吸光值。 5、同时设置调零孔（培养基、MTT、二甲基亚砜），对照孔（细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、MTT、二甲基亚砜），每组设定3复孔。 |
10楼2009-08-22 11:43:32
