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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 药学 » 药理学 » SRB测定和MTT法的问题
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a83875785

铁杆木虫 (著名写手)

[交流] SRB测定和MTT法的问题

最近提取出来一些单体和混合物，老板让做SRB测定和MTT法测定实验，可是本人是天药专业的，本人或者本实验室从来没有此类实验的经验，也不知道该怎么做，想请问各位大侠们：SRB反应或者MTT实验怎么做，或者哪本书上有介绍这2种实验的做法，不甚感激！
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细胞培养

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1楼 2009-08-16 09:58:31
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liuliyanemily

木虫 (著名写手)

会飞的虫虫
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
你看下《药理实验方法学》
徐淑云和卞如濂等编的
还有陈奇的《中药药理实验方法学》吧
里面应该会有一些介绍！

[ Last edited by liuliyanemily on 2009-8-16 at 23:02 ]
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一直在努力，总会有成功......
2楼2009-08-16 23:00:36
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lxj46

金虫 (正式写手)
属于分子生物学的实验，找个人跟着做两天就全知道了，机器人干的活，没什么技术含量
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这是最好的年代，人民不需要自由！
3楼2009-08-20 10:49:07
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tjegg

铁杆木虫 (著名写手)
引用回帖:
Originally posted by lxj46 at 2009-8-20 10:49:
属于分子生物学的实验，找个人跟着做两天就全知道了，机器人干的活，没什么技术含量

是细胞生物学实验，操作虽简单，做好了不容易。

回楼主，建议SRB用于贴壁细胞，用CCK8测定悬浮细胞，现在很少人用MTT了。
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除了你的亲人，没有人应该对你好，对你好的人，一定要珍惜。
4楼2009-08-20 13:16:42
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笨笨猪0608

铁杆木虫 (职业作家)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
MTT简单啊，我看还是有很多人用麽
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5楼2009-08-20 14:31:22
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a83875785

铁杆木虫 (著名写手)
3楼的英雄，请问哪里有描述此类实验的参考书呢，我是一窍不通啊
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6楼2009-08-21 09:42:46
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笨笨猪0608

铁杆木虫 (职业作家)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
引用回帖:
Originally posted by a83875785 at 2009-8-21 09:42:
3楼的英雄，请问哪里有描述此类实验的参考书呢，我是一窍不通啊

你那边有细胞实验室麽？让他们带着你做几回就好，都是基本实验操作，很容易上手的
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7楼2009-08-21 09:49:53
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a83875785

铁杆木虫 (著名写手)
引用回帖:
Originally posted by 笨笨猪0608 at 2009-8-21 09:49:


你那边有细胞实验室麽？让他们带着你做几回就好，都是基本实验操作，很容易上手的

有是有！但不知道人家做不做...我想自己搞...
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8楼2009-08-21 10:48:48
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笨笨猪0608

铁杆木虫 (职业作家)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
引用回帖:
Originally posted by a83875785 at 2009-8-21 10:48:


有是有！但不知道人家做不做...我想自己搞...

细胞实验室肯定天天有人在的，不然细胞怎么长啊。跟那边老师说下，去请教下他手下的学生，谦虚总能学到东西。你自己搞也是要去细胞房做的，还要用他们的培养箱啊之类的，早晚要跟他们接触
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9楼2009-08-21 14:14:19
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小丫2212

木虫 (小有名气)
★
karl2100(金币+1,VIP+0):多谢提供！ 8-22 22:11
药物MTT法实验步骤

（1）贴壁细胞：
1: 收集对数期细胞，调整细胞悬液浓度，每孔加入100ul,铺板使待测细胞调密度1000- 10000 /孔，（细胞浓度的问题见后面的注意事项）。
2: 5%CO2，37℃孵育，至细胞单层铺满孔底（96孔平底板）,加入浓度梯度的药物,原则上，细胞贴壁后即可加药，或两小时，或半天时间，但我们常在前一天下午铺板，次日上午）加药.一般5-7个梯度,每孔100ul,设3-5个复孔.建议设5个，否则难以反应真实情况
3: 5%CO2，37℃孵育16-48小时，倒置显微镜下观察。
4: 每孔加入10ulMTT溶液（5mg/ml，即0.5%MTT），继续培养4h。若药物与MTT能够反应，可先离心后弃去培养液，小心用PBS冲2-3遍后，再加入含MTT的培养液。
5: 终止培养，小心吸去孔内培养液。
6: 每孔加入100ul二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10min，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪OD490nm处测量各孔的吸光值。
7: 同时设置调零孔（培养基、MTT、二甲基亚砜），对照孔（细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、MTT、二甲基亚砜）。
（2）悬浮细胞：
1: 收集对数期细胞，调节细胞悬液浓度1×106/ml（细胞浓度的问题见后面的注意事项），按次序将①补足的1640（无血清）培养基40ul ；②加Actinomycin D（有毒性）10ul用培养液稀释 (储存液100mg/ml，需预试寻找最佳稀释度，1:10-1:20)；③需检测物10ul；④细胞悬液50ul（即5×104cell/孔），共100ul加入到96孔板（边缘孔用无菌水填充）。每板设对照（加100ml 1640）
2: 置37℃，5%CO2孵育16-48小时，倒置显微镜下观察。
3: 每孔加入10 ul MTT溶液（5 mg/ml，即0.5%MTT），继续培养4 h。（悬浮细胞推荐使用WST-1，培养4 h后可跳过步骤4），直接酶联免疫检测仪OD570nm（630nm校准）测量各孔的吸光值）
4、离心（1000转x10min），小心吸掉上清，每孔加入100 ul二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10 min，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪OD570nm（630nm校准）测量各孔的吸光值。
5、同时设置调零孔（培养基、MTT、二甲基亚砜），对照孔（细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、MTT、二甲基亚砜），每组设定3复孔。
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10楼2009-08-22 11:43:32
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