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引物设计 已有2人参与
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本人做转化 设计好的引物本想扩增载体里基因的序列 但是没转的阴性对照也显示出条带 想问下大家 应该怎么设计引物能避免这种情况发生呢 谢谢啦 发自小木虫Android客户端 |
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3楼2021-07-09 14:53:47
原海亮
木虫 (著名写手)
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【答案】应助回帖
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由于看不到你pcr的电泳图，不清楚阴性对照有条带是什么样子？大小是多少？和目的条带一样么？条带的浓度和清晰度如何？ 因为如果是以质粒为模板进行PCR ，出现非特异性条带的概率还是比较低的，即相对于基因组做模板，质粒模板对引物的质量要求不是特别高，一般都可以很好的获得特异性目的条带。 出现你这种情况，可以试着分析： 1、对比阴性对照和实验组，pcr获得条带是否一样？获得的条带是目的条带还是非特异性条带？有没有可能没有获得目的条带，而是引物二聚体？（可增加不加引物的阴性对照）。 2、确定模板正常，阴性对照使用的水是否有污染？实验组使用的质粒浓度如何？配制体系时候是否有交叉污染的可能？ 3、引物设计是以质粒载体为模板设计的？还是以基因组模板设计，然后用质粒扩增？按道理质粒大小一般在10K以下，这么小的模板出现非特异性的概率还是比较低的，除非你的引物质量太差，或者加入酶切位点后导致引物质量下降？ 最好可以放一张电泳图供参考，祝好！ |
2楼2021-06-18 08:44:06
