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木查yan

新虫 (初入文坛)

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[求助] 引物设计已有2人参与

本人做转化设计好的引物本想扩增载体里基因的序列但是没转的阴性对照也显示出条带想问下大家应该怎么设计引物能避免这种情况发生呢谢谢啦

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1楼 2021-06-17 09:35:36

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原海亮

木虫 (著名写手)

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【答案】应助回帖

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由于看不到你pcr的电泳图，不清楚阴性对照有条带是什么样子？大小是多少？和目的条带一样么？条带的浓度和清晰度如何？

   因为如果是以质粒为模板进行PCR ，出现非特异性条带的概率还是比较低的，即相对于基因组做模板，质粒模板对引物的质量要求不是特别高，一般都可以很好的获得特异性目的条带。

   出现你这种情况，可以试着分析：

   1、对比阴性对照和实验组，pcr获得条带是否一样？获得的条带是目的条带还是非特异性条带？有没有可能没有获得目的条带，而是引物二聚体？（可增加不加引物的阴性对照）。

   2、确定模板正常，阴性对照使用的水是否有污染？实验组使用的质粒浓度如何？配制体系时候是否有交叉污染的可能？

   3、引物设计是以质粒载体为模板设计的？还是以基因组模板设计，然后用质粒扩增？按道理质粒大小一般在10K以下，这么小的模板出现非特异性的概率还是比较低的，除非你的引物质量太差，或者加入酶切位点后导致引物质量下降？

   最好可以放一张电泳图供参考，祝好！