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质粒提取问题 已有1人参与
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连载体，阳性验证，质粒不是环状吗？咋提出来是这种？求大佬帮忙分析下！ 发自小木虫Android客户端 |
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原海亮
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【答案】应助回帖
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如果你是提取的质粒直接进行电泳，这样的电泳图是正常的，质粒本身是环状的结构，但在细胞环境内或者不同的生命周期里，常常存在质粒超螺旋的结构（比如在圆环的基础上，继续螺旋呈麻花状的超螺旋结构），而我们目前抽提质粒的方法，没办法保证质粒维持在一种结构，无论是物理剪切力还是试剂原因，都会导致质粒开环甚至成为线性的DNA。 换句话讲，你抽提质粒后，其实里面有可能会出现质粒的两种到三种结构：超螺旋结构，开环结构，线性结构。而这三种不同的结构在进行琼脂糖电泳的时候，迁移速度是不一样的，导致一个质粒的胶图会出现两条带甚至三条带（迁移速度通常是：超螺旋>线性>开环）。 楼主电泳目的是为了检测克隆阳性，那么简单的跑质粒是没有意义的（当然可以起到检测抽提质粒浓度的作用），重组载体真实大小的通常是看线性质粒的位置大小（开环或者超螺旋结构因为存在复杂的二级或者三级结构，其电泳迁移速度不仅仅是和片段大小相关，故不能真实反映片段长短），所以你如果需要通过提质粒筛选阳性克隆的话，是应该对质粒进行单酶切或者双酶切后，再进行电泳检测，这时候的结果才对筛选克隆有参考价值，祝好！ |
2楼2021-06-11 09:04:25