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张小蛋

新虫 (小有名气)

[求助] 构建质粒,目的基因前加信号肽导致目的基因缺失或大肠杆菌致死已有1人参与

发现了有趣的现象
在构建质粒过程中,在目的基因前加信号肽导致会目的基因序列缺失或大肠杆菌致死,大家有没有遇到这样的情况?或者大概分析一下可能是哪些原因呢?
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pennchem

专家顾问 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
基因缺失或致死是因为细胞毒性么?有点好奇是什么基因,分泌到periplasm还是到培养基里?

可能原因很多,比如在胞内无法正确折叠,不会致死,但是加了信号肽,能正确折叠了,毒性就出来了,,,
行至水穷处,坐看云起时
2楼2021-06-10 10:35:29
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张小蛋

新虫 (小有名气)

引用回帖:
2楼: Originally posted by pennchem at 2021-06-10 10:35:29
基因缺失或致死是因为细胞毒性么?有点好奇是什么基因,分泌到periplasm还是到培养基里?

可能原因很多,比如在胞内无法正确折叠,不会致死,但是加了信号肽,能正确折叠了,毒性就出来了,,,

表达的ccdB毒蛋白基因,这个基因在DB3.1菌株里面是不致死的,但是加了信号肽之后,测序发现ccdB基因发生了缺失,那可能是由于信号肽的存在,导致毒性增强了?
还有就是又克隆了一个普通的酶,以信号肽+酶的形式构建质粒,这个质粒就构建不出来了,涂抹到平板上是不长的出现了致死的现象,觉得很奇怪
3楼2021-06-15 10:20:54
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pennchem

专家顾问 (正式写手)

【答案】应助回帖

ccdB蛋白的毒性作用是通过与促旋酶GyrA亚基第462位氨基酸相结合使得DNA断裂后不能进行修复,DNA合成受阻,导致细胞死亡。

DB3.1菌株的细胞含有gyrA462基因,能够表达GyrA亚基蛋白与ccdB结合的区域,可以竞争性抑制ccdB蛋白的活性,使得促旋酶可以正常行使功能,实现含有ccdB的载体的正常扩增。

-------------------------以上转自豆丁

根据以上信息, 是不是可以理解为信号肽可能是ccdB蛋白在空间上逃逸GyrA的结合, 从而致死(这只是推测, 可能性之一吧)
行至水穷处,坐看云起时
4楼2021-06-15 21:53:22
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