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myselfsky8159

木虫 (著名写手)

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[交流] 植物线粒体提取的方法

关于植物线粒体提取的方洗。。。请高手赐教。。。

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1楼2009-08-10 17:25:53

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laojiu9878

至尊木虫 (知名作家)

九牛

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amisking(金币+4,VIP+0):欢迎发帖交流，但是希望能够整理一下在发布！ 8-11 12:40
myselfsky8159(金币+3,VIP+0):谢谢。。 8-11 14:40

取暗培养10 天左右、长约10-15 cm 的水稻黄化苗30 g, 用20% 次氯酸钠表面消毒10min, 然后用预冷无菌水冲洗，用无菌纱布吸干水，然后用剪刀将黄化苗截成约1 mm 的小段, 加入3倍体积的匀浆缓冲液(50 mmol/l Tris-HCL , PH 8. 0、0. 3 mol/L 甘露醇、0.2 mol/L 蔗糖、1mmol/L EDTA , PH 8. 0、0. 1% BSA、0. 6% PV P、2-巯基乙醇), 用预冷的高速组织匀浆捣碎机破碎组织,10min后加入2倍体积缓冲液(蔗糖0.3 mol/L、T ris-HCl 50 mmol/L )静置20min，经4层纱布过滤, 离心管分装滤液。将滤液离心20 min (12 000 r/min, 4℃), 弃上清。向沉淀中加入悬浮液(50 mmol/L Tris-HCL , PH 8. 0、0.3 mol/L 甘露醇、0.2 mol/L 蔗糖、0. 1% BSA、0. 6% PVP) , 用毛笔轻刷沉淀使之充分悬浮,将悬浮液离心10 min （12000 r/min， 4℃）, 得到粗线粒体沉淀。然后向沉淀中加入10 mL 缓冲液(蔗糖0. 3mol/L、T ris-HCl 50mmol/L ) , 终浓度为0. 01 mol/L 6μΙ MgCl2, 分别加入0.6 μΙ，1.0 μΙ，1.4 μΙ，1.8 μΙ的DNase (150 μg/mL), 4℃保温1～2 h，并且每隔20 min轻摇一次。加入EDTA 至终浓度20 mmol/L ,中止DNase I 反应。将此溶液小心置于20 mL 0.6 mol/L蔗糖溶液介质上(0.3 mol/L 甘露醇、50 mmol/LTris-HCL， 0.6 mol/L 蔗糖) , 10000 r/m in离心20 min, 所得的沉淀为较纯的线粒体。