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【资源】转：反相制备型高效液相色谱法分离纯化过程中的共性问题
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来源：http://www.antpedia.com/?uid-1099-action-viewspace-itemid-47080 内容概览： 本文拟通过一个具体实例来介绍制备型高效液相色谱法的特点、影响制备型高效液相色谱分离纯化的因素，及其在合成药物、中药化学对照品研究中的实际应用，并对制备HPLC分离纯化过程中的共性问题做了总结并提出解决方案。 实际应用：某合成药物最终产品的纯化，对其纯度的要求——HPLC-UV法，210 nm & 254 nm下，以峰面积归一化法，≥98.0%，同时需提供MS、NMR数据。 具体问题：某特定化合物系强极性有机小分子，极性大、难挥发，采用硅胶柱层析不易提纯，需用其他分离技术来纯化。 解决方法：终极目的是提纯该物质。总体策略——“先看，后想，再行动”——“看化学结构，想理化性质，定纯化方法”。由于该化合物及相关杂质的理化性质决定了难以用常规的重结晶、蒸馏（精馏）、硅胶柱层析来分离纯化。结合实验室的具体条件，考虑采用反相制备型高效液相色谱法（Preparative HPLC）来分离纯化之。 方法步骤：1.了解样品及有关组分的情况→2.样品预处理→3.建立Analytical HPLC Method→4.优化Preparative HPLC条件→5.检查出现的问题→6.回收纯化的物质。 更细致地来讲，开始Preparative HPLC之前须明白：待分离样品及有关组分的信息——所含化合物的结构信息（重点关注酸、碱性等极性基团）、UV光谱图（涉及到后续试验检测波长设定）、分子量（分离后目标化合物LC-MS检测确认）、待分离体系的复杂程度（所含化合物的数目，preparative HPLC之前是否须经flash column粗分）； 样品预处理——最主要的是样品的溶解度（将尽量多的样品溶于体积相对较小的溶液中）以及待分离体系里是否含强酸、强碱性物质（潜在的“柱杀手”），样品溶液是否需要中和等； 建立Analytical HPLC Method——这一步，跟平常的HPLC相似，重点关注待分离的目标化合物，使该物质与其前、后组分分离得尽量相隔远些（起码得基线分离，利于后续制备时放大），若流动相中必须添加改性剂，应尽量避免非挥发性的缓冲盐，优先选择易挥发性缓冲液（例如甲酸、乙酸、三氟乙酸、甲酸铵、乙酸铵、三乙胺、氨水等），否则要脱盐，得二次分离； 优化Preparative HPLC条件——通常来讲，制备柱是实验室现有的（色谱柱就这么定下来了，没得选择的余地，除非是需新购色谱柱），在Analytical HPLC的基础上优化梯度分离方法、考察进样量、目标组分收集确认（LC-MS测分子量）； 检查出现的问题—— 这一步是最需要费心留神的！很多时候，出了问题，根本就没有挽回的余地，当然了，有时也是亡羊补牢，犹为未晚；所以，更多的时候，是需要未雨绸缪，把可能会发生的事情尽量考虑周全！比如样品的溶解度（在甲醇、水、乙腈、流动相、四氢呋喃那、酸水、碱水中的溶解性如何？），若样品溶解性不好，第一步就卡住，很打击人滴！曾遇到过这么个实例——一个某种酶抑制剂，含氮杂环类化合物，在上面提到的那些溶剂中溶解度都相当地小，analytical HPLC虽然分离得很漂亮，但还是没法做。最后是通过结构修饰，在某活性基团上上个保护基，纯化，再脱保护，曲径通幽，绕了个圈才搞定！再比如，样品的酸碱稳定性、热稳定性，这涉及到分离后，如何除去流动相问题。若样品在酸性、碱性、加热等条件下，会变坏，那得万分谨慎了。虽困难，到从合成的角度来讲，也容易判断，合成过程中是否耐受过酸、碱、高温等剧烈条件，很多时候，可从这儿推测出样品的稳定性。同时，也可以回到出发点——了解样品结构信息，是否含氰基-CN、活性酯键、游离氨基、游离羧基等，以防去除流动相过程中发生氰基变酰胺、酯水解、酸催化酯化等等情况，基础有机化学方面的知识可以派上用场。 回收纯化的物质——万里长征最后一步，但极其需要走稳，否则就前功尽弃、徒劳无益了。可以先低温旋蒸掉乙腈（甲醇）后，再溶剂萃取或者沉淀出目标化合物；若热稳定性好的话，也可以直接旋蒸干水，或者用油泵拉干，量少的话。冷冻干燥也可以派上用场。具体情况具体分析吧。需要留心的是，虽然挥发性添加剂会旋蒸掉，但也不可能一蹴而就，在旋蒸过程中，梨形瓶里面的收集液酸碱性会越来越强的，相当于浓缩了酸碱，需要注意这个过程中目标化合物的稳定性，是否顶得住。 具体实例：某强极性、含氮碱性化合物的分离纯化 上面简单陈述了反相制备型高效液相色谱法分离纯化的基本流程及方法建立过程中的注意事项，下面，聊一个自己的亲身经历，在这次分离纯化过程中，该发生和不该发生的状况都遇到了，痛定思痛，与大家分享一下，前事不忘后事之师！ 对该强极性、含氮碱性化合物，先在analytical HPLC上摸索分离条件，初次尝试乙腈-水体系，流动相中不添加任何改性剂，结果，分离效果极不理想，出峰偏早且色谱峰形差，拖尾严重！考虑在流动相中添加Formic Acid，调pH 2.0，抑制色谱柱残留硅羟基的解离，从而降低硅羟基效应。这么一试，效果立竿见影，再微调梯度洗脱强度，就这样在analytical HPLC的条件模式好了，下一步，转移到preparative HPLC上。制备分离之前，在溶解样品的时候，又遇到麻烦了，该化合物在纯甲醇、纯水中溶解度都不怎么好，甲醇-水混合溶剂，还是不咋的——成了乳浊液了，跟牛奶似的，考虑到流动相里添加了酸，而该化合物又是碱，于是乎，滴加甲酸助溶，边滴加边振摇，样品终究给溶清了，0.45um滤过，备用，待分离。 先试试，小体积进样；观望ing，期待ing，留意系统反压，居然比平时类似色谱条件下，柱压高了1000多psi，眉头紧锁，有问题？！果然，出峰不正常，很快就出来了，居然没怎么保留！！！检查管路，流动相设置是否对应，没问题呀，难不成样品有问题？询问合成的同事，这个化合物是怎么做过来的。不问不知道，一问吓一跳！！！样品含脂肪胺（二乙烯三胺），是反应起始原料之一，由于其沸点高（～200℃）旋干溶剂的时候根本没有除去。赶紧测样品溶液的pH值，10左右，汗ing～～～，好在第一针是预试，进样体积小，不然制备柱就。。。。。。先前溶解样品时都用甲酸助溶了，没想到碱性居然还有这么强，没办法，只得中和了。调整到偏酸性了，再次尝试。这下倒是一切正常了，分离效果也不错！耶～∨，经这么折腾，梯度洗脱条件基本固定下来了，然后优化考察进样量，逐步增大上样量，正常，分离效果不错，再增加进样体积，还是分得不错！进一步增大，居然很快就洗下来了，明显地不正常！仔细一想，看来这个低分子有机胺对色谱分离是有影响的，只是在分析条件下、小体积进样一时没有表现出来而已。既然是游离伯胺，能否用铜离子去络合呢？但是目标化合物也含有这个片段，也会同时被络合掉，没办法，看来只能小体积进样了，少量多次啦！ 就这样，一针、两针、三针。。。。边分离，边让同事回收已经收集好的组分。。。一天过去了。。。 担心旋蒸去除溶剂的过程中样品变坏，取已经脱除溶剂的样品做个NMR H谱，结果大事不妙，噩耗啊，H谱上居然多出了个峰，仔细一看，甲酸意外地跟氨基干上了，旋蒸过程中游离伯胺被甲酰化了，苦笑不得呀。冷静想想也正常，甲酸HCOOH，具有醛基，跟胺反应了。。。幸好，幸好只溶解了少量的样品，大部分的膏状物还放在一边，还能经得起这次折腾。。。（突然想起来老子的——“祸兮福之所倚，福兮祸之所伏”或者说“成也萧何，败也萧何”） 看来，这种情况之下是不能用甲酸作为流动相添加剂了，改用TFA，况且TFA沸点比Formic Acid低，容易去除。就这么改过来了，试试，效果还不错！但是有个潜在的问题没解决——体系里脂肪胺对色谱分离的影响！！这个比较麻烦，虽少量多次可以做，但太耗费时间和流动相了，还是得想办法增大进样量。于是乎，斗胆，大体积进样一针，试试看？！结果正常，让人惊喜啊！再试试，看能否重复？结果令人失望！邪乎？再试，正常，再试，又不正常。。。这么个周期下来很可能是上一针对下一针的色谱分离有影响。但不敢肯定，于是乎，进个空白，再进样品，正常！！！如今，华山两条道——要么一针样品一针空白，要么想个法子把胺的影响消除掉。一针样品一针空白，这么做太费时间了，也耗溶剂。能否把胺给洗掉呢？仔细分析上面的图谱，发现上一针跟硅羟基作用的胺在下一针能部分洗下来的。好，好，洗洗看！在洗脱梯度过后增加高比例水洗柱，再平衡柱子。就这么尝试，管用！ 松了口气，就这么连续3天，分离出了足够量的样品。哈哈，搞定！ 没想到，没想到的是，一波为平，一波又起！在去除溶剂回收目标化合物的过程中又出岔子了。旋干溶剂后，样品成了三氟乙酸盐，加碱，调pH值，游离出来！打算这么干，将三氟乙酸除掉，可惜，三氟乙酸居然不能完全除去，做NMR19F谱，在化学位移-73左右能明显看到TFA的峰，可怜那位做合成的同事啊。。。只能再来一次纯化了，过离子交换树脂，除去TFA。这部分的工作是意料之外的。幸好，幸好能搞掉，不然in vitro pharmacolog怎么办呀，TFA不把那些细胞毒死才怪！！！ 至此，事情有个令人满意的结局了，虽然中途破费周折。痛定思痛，从这个case中，可以得出三点启发： 1. Preparative HPLC分离纯化之前，必须对待分离化合物体系有充分的了解。诸如目标化合物的溶解度——在流动相中的溶解度显得非常重要。若溶解性差，易于柱头析出，小心添“堵 ”！另外，对于合成产物纯化而言，由于反应种类繁多、体系复杂，所用溶剂、酸碱催化剂均有可能对色谱分离产生影响（诸如合成反应过程中所用TFA、TEA、DEA、甲/乙基磺酸、三氟甲磺酸、吡啶、脂肪胺等）。进样之前，是否需要预处理（比如调节样品溶液pH） 2. Preparative HPLC分离纯化过程中，需实时密切关注系统压力，留意仪器设备工作状态。若有反常现象则意味着某处有潜在的问题，考虑从样品溶液、流动相、仪器本身、色谱柱、检测器等各个方面排查。 3. Preparative HPLC分离纯化之后，在回收目标化合物时，需对其耐酸、碱性、热稳定性有所了解，谨防最后一步出乱子。同时，结合具体情况，留心防范流动相添加剂的“副作用”。 “且做且学，且学且做，且做且行，且行且珍惜……” [ Last edited by maomi520 on 2009-8-8 at 11:52 ] |
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