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墨小诔

新虫 (初入文坛)

[交流] 请教！双酶切一直不成功

想做原核表达。TA克隆测序成功的质粒以及PET-28a载体双酶切后连接。TA克隆时连接的载体是全式金的simple cloning vetor。
质粒1与pet28a是用HindIII和BamHI（takara的快切酶）。质粒2与pet28a是用NcoI和BamHI（takara的快切酶）。采用的先30度3小时切BamHI，然后37度3小时切HindIII（质粒2相同条件）。用的50的体系，两种酶各1，green buffer5，质粒3。
酶切后电泳图如下，质粒1，2长度约2000bp,泳道1为5000marker,后几个孔分别为质粒1，载体，质粒2，载体。
想问的问题:
1.酶切后直接电泳？看到有朋友先高温失活再电泳。
2.酶切不成功，但是条带怎么这样？求解
3.如何正确酶切？

请教！双酶切一直不成功


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1楼 2021-01-19 17:46:54
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jurkat.1640

至尊木虫 (文坛精英)
★ ★ ★
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墨小诔(fuyuandj86代发): 金币+2 2021-01-30 11:34:35
酶减半，过夜酶切。心急吃不了热豆腐。
或者T载体上的酶切位点发生突变。
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3楼2021-01-22 12:19:28
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fuyuandj86

版主 (著名写手)

己所不欲，勿施于人
(1) 无论是高温失活后再电泳还是直接电泳应该都不碍事
(2) pet28a是不是切出来了这个图看不出来，因为切出来的短片段太小了，所以理论上只能看到一个相当于pet28a载体长度的线性片段
(3) 检查一下双酶切buffer是不是合适，同时用两个酶切的话buffer按这个表格走：https://www.takarabio.com/us/pro ... e_digestion_buffers
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The doer of good becomes good, the doer of evil becomes evil.
2楼2021-01-20 17:18:53
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snoopyzxx

木虫 (著名写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
电泳质量不好。先把marker跑整齐啊。电泳夜不对？

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生物资源交流QQ群：1044518333
4楼2021-01-22 13:12:22
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snoopyzxx

木虫 (著名写手)
★ ★
墨小诔(fuyuandj86代发): 金币+2 2021-01-30 11:34:20
切没切开，你要同时跑没有酶切的质粒。切前切后发现有区别的。

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生物资源交流QQ群：1044518333
5楼2021-01-22 13:13:02
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