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墨小诔

新虫 (初入文坛)

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[交流] 请教！双酶切一直不成功

想做原核表达。TA克隆测序成功的质粒以及PET-28a载体双酶切后连接。TA克隆时连接的载体是全式金的simple cloning vetor。
质粒1与pet28a是用HindIII和BamHI（takara的快切酶）。质粒2与pet28a是用NcoI和BamHI（takara的快切酶）。采用的先30度3小时切BamHI，然后37度3小时切HindIII（质粒2相同条件）。用的50的体系，两种酶各1，green buffer5，质粒3。
酶切后电泳图如下，质粒1，2长度约2000bp,泳道1为5000marker,后几个孔分别为质粒1，载体，质粒2，载体。
想问的问题:
1.酶切后直接电泳？看到有朋友先高温失活再电泳。
2.酶切不成功，但是条带怎么这样？求解
3.如何正确酶切？

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1楼2021-01-19 17:46:54

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jurkat.1640

至尊木虫 (文坛精英)

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墨小诔(fuyuandj86代发): 金币+2 2021-01-30 11:34:35

酶减半，过夜酶切。心急吃不了热豆腐。
或者T载体上的酶切位点发生突变。

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3楼2021-01-22 12:19:28

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fuyuandj86

版主 (著名写手)

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管辖: 生物科学

(1) 无论是高温失活后再电泳还是直接电泳应该都不碍事
(2) pet28a是不是切出来了这个图看不出来，因为切出来的短片段太小了，所以理论上只能看到一个相当于pet28a载体长度的线性片段
(3) 检查一下双酶切buffer是不是合适，同时用两个酶切的话buffer按这个表格走：https://www.takarabio.com/us/pro ... e_digestion_buffers

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The doer of good becomes good, the doer of evil becomes evil.