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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 蛋白/酶 » 酶容易降低酶活怎么办？
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卷卷康小西

银虫 (小有名气)

[交流] 酶容易降低酶活怎么办？

用大肠杆菌表达胞内酶，每次都是从-80℃划线后再培养的，但发现前几次实验酶活还可以，后面重复的时候发现酶活降低了很多，培养条件都是一样的……很是惆怅……
有大佬了解是什么原因吗？还有，大肠杆菌菌体如果放冰上过夜再破壁的话，会对酶活有影响吗？
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1楼2020-12-13 23:38:38
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fuyuandj86

版主 (著名写手)
★
卷卷康小西(金币+2): 谢谢参与
大肠杆菌冰上过夜会对酶活有影响。很多酶都不稳定，随着冻融或放置活性会降低。
酶活测量是用菌液还是纯化后的蛋白？如果是菌液的话，最好先定量一下表达水平，不要默认每次表达水平一样。
纯化蛋白尽量在一天内完成，除非需要透析。
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5楼2020-12-14 10:36:44
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卷卷康小西

银虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by fuyuandj86 at 2020-12-14 10:36:44
大肠杆菌冰上过夜会对酶活有影响。很多酶都不稳定，随着冻融或放置活性会降低。
酶活测量是用菌液还是纯化后的蛋白？如果是菌液的话，最好先定量一下表达水平，不要默认每次表达水平一样。
纯化蛋白尽量在一天内完 ...

感谢回复，是把菌体离心放冰上的
请问这个菌液的表达水平要怎么定量呢？是通过蛋白浓度定量吗？
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14楼2020-12-17 08:31:55
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fuyuandj86

版主 (著名写手)
引用回帖:
14楼: Originally posted by 卷卷康小西 at 2020-12-17 08:31:55
感谢回复，是把菌体离心放冰上的
请问这个菌液的表达水平要怎么定量呢？是通过蛋白浓度定量吗？...

WB定量菌液破碎后的上清。
当然有的时候诱导表达的条带在总可溶蛋白中非常明显，可以跑一个总可溶蛋白的考马斯蓝染色就够了。
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15楼2020-12-18 10:08:01
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tzynew2楼
2020-12-13 23:51   回复  
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syhorchid3楼
2020-12-13 23:58   回复  
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1
miaojiabing4楼
2020-12-14 10:11   回复  
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8
wqw8234256楼
2020-12-14 10:52   回复  
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苏州华博7楼
2020-12-14 12:58   回复  
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1
nono20098楼
2020-12-15 17:54   回复  
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·
mikeshen1019楼
2020-12-15 21:14   回复  
卷卷康小西(金币+2): 谢谢参与
gg
塞北先生10楼
2020-12-16 00:45   回复  
卷卷康小西(金币+2): 谢谢参与
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塞北先生11楼
2020-12-16 00:45   回复  
BiotageAB12楼
2020-12-16 10:44   回复  
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1
M塞北13楼
2020-12-16 12:57   回复  
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mikeshen10116楼
2020-12-18 12:34   回复  
yy
Multiply17楼
2020-12-18 13:32   回复  
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.
yucimei118楼
2020-12-18 13:51   回复  
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hao
psylhh19楼
2020-12-19 00:27   回复  
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lihe13120楼
2021-09-09 11:52   回复  
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