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zhubin0815

木虫 (小有名气)

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[求助] 大肠杆菌扫描电镜观察已有1人参与

虫友们，最近在做大肠杆菌培养与扫描电镜观察，样品准备步骤是从文献上扒的（之前无基础

），发现得到的图片与文献中不同

，好像有东西未洗干净的样子（见附件），所以怀疑步骤有问题，求各位大神指点迷津

，具体步骤如下：
1. 用10 μL枪头挑取菌种接种到含有20 mL的LB液体培养基中，在摇床中150 r/min 培养24 h。
2. 用接种环沾取一环的菌量，在固体培养基上进行划线分离；
3. 挑取平板上出现的单一菌落接种到含有20 mL的LB液体培养基中，在摇床中150 r/min 培养24 h。
4. 用移液枪吸取250 μL到50 mL的LB液体培养基中，在摇床中150 r/min 培养16 h。
5. 然后用PBS缓冲液洗3次，每次离心机6000转离心6分钟。
6. 取20 μL稀释后的菌液滴在洁净的边长为5 mm的硅片上；
7. 与37 ℃的烘箱内干燥至半干；
8. 将处理后的载玻片置于2.5%（体积比）的戊二醛的磷盐酸缓冲液中浸泡24小时，来对细菌进行固定；
9. 用0.1M pH7.0 PBS溶液润洗三次（每次15 min），洗去载菌玻片上的戊二醛磷酸盐缓冲液；
10. 放置在30%，50%，75%，85%和95%的乙醇梯度溶液中进行脱水处理；（30%乙醇→50%乙醇→75%乙醇→85%乙醇→95%乙醇，每一级15 min，再用100%的乙醇处理2次，每次20 min）
11. 脱水处理后的载菌玻片置于烘箱中37 ℃进行干燥处理。
12. 扫描电镜喷铂后观察。