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libosnow

新虫 (初入文坛)

[交流] 定量PCR两步法和三步法请教

我做定量PCR,目的基因均采用的是两步法,但是内参基因(actin beta)用两步法时标准曲线不好(样品跑出来溶解曲线正常,但是用扩增产物等倍数稀释后发现所有的标准曲线溶解曲线出现小峰,即引物二聚体,排除污染),开始不知道什么原因,最后换用三步法小峰消失。

我想请问的是:
目的基因采用两步法,内参基因采用三步法进行扩增,扩增条件不一致(但是同一基因所用条件完全一致),这样对结果影响大吗?

谢谢解答!

[ Last edited by 350784478 on 2009-8-4 at 15:36 ]
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libosnow

新虫 (初入文坛)

谢谢大家的热心帮助
6楼2009-07-23 00:43:40
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houjinglhy

荣誉版主 (文坛精英)

表达自由,人权之基。

优秀版主


libosnow(金币+1):谢谢参与
RT-PCR  不清楚 友情帮顶
从小就学习鲁迅,直到现在才体会到他当时是多么的绝望和无助,却仍要用尽最后一丝力气声嘶力竭的呐喊!
2楼2009-07-22 18:46:14
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六妖妖

金虫 (正式写手)

★ ★
libosnow(金币+1):谢谢参与
libosnow(金币+1,VIP+0): 7-23 00:41
按理来说内参基因应该对温度的适应性更强。我一般会让内参基因的退火温度迁就于目标基因。我个人觉得2步法跟3步法扩增对数据处理没有多大影响。主要是2条标准曲线的E值是否满足做相对定量的要求。
3楼2009-07-22 20:05:25
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魔法帝国


libosnow(金币+1):谢谢参与
帮楼主顶一下贴O(∩_∩)O~
4楼2009-07-22 21:52:31
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