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DNA浓度
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| 呵呵，小女才疏学浅。想请教：用分光光度法测DNA浓度时，OD值就是DNA的紫外吸收值吗？ |
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2楼2009-07-22 10:55:05
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5楼2009-07-22 11:03:53
rainbamboo8707
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chunlian(金币+2,VIP+0):谢谢！ 7-22 12:35
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OD值 1. 朗伯——比尔（Lambert－beer）光吸收定律： A＝－lgT＝εb c A——吸光度，又称光密度“O.D”。 T——透光度， T＝I / I。， I。——为照射到吸收池上的光强，I——为透过吸收池的光强。 ε——摩尔吸光系数或克分子吸光系数（L•mol－1•cm－1）。 b——样品光程（cm），通常使用1.0cm 的吸收地，b=1cm。 C¬——样品浓度（mol/L）。 由上式可以看出：吸光度A与物质的吸光系数“ε”和物质的浓度“C”成正比。 2. DNA和RNA的OD值 2.1 原理 嘌呤碱和嘧啶碱具有共轭双键，使碱基、核苷、核苷酸和核酸在240~290nm的紫外波段有一强烈的吸收峰，因此核酸具有紫外吸收特性。DNA钠盐的紫外吸收在260nm附近有最大吸收值（图3-25），在230nm处为吸收低谷，其吸光率（absorbance）以A260表示，A260是核酸的重要性质，RNA钠盐的吸收曲线与DNA无明显区别，蛋白质在280nm处有最大的吸收峰，盐和小分子则集中在230nm处，对于纯的核酸溶液，测定A260，即可利用核酸的比吸光系数计算溶液中核酸的量，核酸的比吸光系数是指浓度为1μg／mL的核酸水溶液在260nm处的吸光率，天然状态的双链DNA的比吸光系数为0.020，变性DNA和RNA的比吸光系数为0.022。据朗波－比尔光吸收定律A＝-lgT＝εbc知，c＝A/εb，而b通常为1cm，所以，通常以1OD值相当于50μg／mL双螺旋DNA，或40μg／mL单螺旋DNA（或RNA），或20μg／mL寡核苷酸计算。 2.2 纯度 DNA和RNA的纯度可以通过测定260nm，230nm和280nm的紫外吸收值来测定，纯的DNA OD260／280在1.8-1.9，OD260／230应大于2.0，纯的RNA OD260／280在1.9-2.0，如果DNA比值高于1.8-1.9，可能有RNA没有去除干净，如果DNA比值小于1.8-1.9，可能含有酚或者蛋白质（RNA中含有酚或者蛋白质比值也会降低），若OD260／230小于2.0说明有残存的盐或小分子杂质污染。 2.3 浓度 DNA和RNA的量，据朗波－比尔光吸收定律A＝-lgT＝εbc知测量样品的浓度为c＝A/εb，又知ε＝0.020，在b＝1cm的情况下，c＝A/（0.020×1）＝50×A，则未稀释的样品的浓度为50×A×稀释倍数（μg／mL）＝50×A×稀释倍数/1000（mg／mL） 2.4 注意事项： 1) 比色杯应为石英杯，玻璃杯在此波长时读数不准。 2) 检测时应使OD260值在 0.15 到1.0之间，数值比较准确。 3) 这种比值测定的方法仅仅适用于核酸浓度大于0.25ul／ml的时候，浓度小于0.25ul／ml的时候测量误差较大。 4) 既含有RNA又含有蛋白质也可能使比值维持在1.8，这个时候要根据电泳情况鉴定是不是含有RNA，或者测定一下是不是含有蛋白质； 5) A260/A280比值可提供DNA纯度的一个参考，但A260/A280 比值会受pH影响。如果未调pH，比值可能与实际差别很大。如果需要准确数值，建议在10 mM Tris Cl, pH 8.5中检测，此时纯净的DNA A260/A280比值应为1.8-2.0（注意应使用同样缓冲液作为对照）。 6) 进行OD值测定时，分光光度计上显示的数值为每毫升溶液中的OD值。 7) 可以在220-330 nm 之间进行扫描，此扫描可以检测是否有其它因素影响OD260，如在325 nm 处有吸光值说明有污染物或比色皿不干净。) 8) DNA的量与260 nm处的吸光度值（OD值）成正比，在引物设计时，1个OD值的合成DNA的重量约为33 mg。 |
6楼2009-07-22 11:09:43
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chunlian(金币+1,VIP+0):谢了！ 7-22 12:36
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OD比值一般在1.8～2.0之间，纯DNA的OD值应为1.8，如果样品中含有蛋白及苯酚等杂质，OD值会偏低。你所测样品的OD值正好是1.8，应该是很标准的了。 测DNA（或RNA）浓度用两种方法： （1）紫外吸收法：也就是测量OD（260）和OD（280）的吸收值，也是最常用的方法，这样的方法其它的杂质对测量结果影响大一点，因为其它杂质在这两个吸收波长也有吸收。 （2）荧光法：用PicoGreen荧光染料，测定DNA，RNA浓度比较灵敏，并且适合测量低浓度和微量DNA和RNA，并且受其它杂质的影响不大，缺点要有专门的荧光检测仪器，试剂比较昂贵。 |
7楼2009-07-22 12:29:25