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sgba0307

铁虫 (小有名气)

[交流] 求助

有没有人做过100bp以下小片段的克隆和表达的兄弟姐妹,我已经做了好久了,一直老是出问题,好郁闷,如果有人做过的话希望能够交流一下,谢谢。
先是p不出来,后来好不容易p出来了切胶回收后跑电泳结果什么都没有,重复好几次了都一样,后来直接连T载体,转化后涂板结果长的密密的比芝麻还小的透明小菌落,挑菌后培养,菌液变浑浊了但是提质粒后双酶切没有出现目的条带,出现的结果真是郁闷啊
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amisking

荣誉版主 (文坛精英)

优秀区长优秀版主

如果没有人帮助你,那么你就去帮助别人。
2楼2009-07-20 21:35:07
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三磷酸腺苷

铁杆木虫 (职业作家)


小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
amisking(金币+0,VIP+0):已经木虫了,你准备冲什么啊?版主? 7-20 21:53
我做过
切胶回收的试剂盒,有些对短片段是无能为力的,直接洗掉
你要好好研究说明书,比如Promega的就有写对多少bp的片段的回收能力是多少

然后,短片段的连接非常难连,我一般选择4度过夜

提质粒之后选择菌落PCR而不要酶切
因为片段那么短,同样摩尔数,质量就非常小,因此在胶上很难观察到
即使通过观察空载体酶切也比较困难,因为切掉的太小,很难判断
3楼2009-07-20 21:42:09
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sgba0307

铁虫 (小有名气)

谢谢指导,还有什么好的经验么》?
4楼2009-07-21 10:17:20
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liby

铜虫 (初入文坛)


小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
100bp片段试着拿乙醇沉淀回收。
做菌液PCR
5楼2009-07-21 10:51:05
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