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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 核酸提取 » 碱裂解后内源性核酸酶会降解质粒吗？
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辛辰昊

金虫 (小有名气)

[求助] 碱裂解后内源性核酸酶会降解质粒吗？ 已有2人参与

质粒稳定性相关文献中提到“The usual procedure to avoid pDNA degradation by endogenous bacterial nucleases is to go ahead promptly with alkaline lysis”,《分子克隆》中介绍碱裂解法时也提到“从细胞中释放DNA，去除与DNA结合的蛋白质并快速使胞内核酸酶失活”。

以上资料都认为，碱裂解后需要避免内源性核酸酶对质粒的降解。而我的问题是，大肠杆菌中的质粒DNA不是会被甲基化修饰从而避免被内源性核酸酶降解吗？因此，裂解后应该并不需要担心质粒被内源性核酸酶降解啊，而且如果质粒会被内源性核酸酶降解，那么裂解之前在大肠杆菌体内岂不早就被降解光了么？

十分期待各位虫友的指导解惑，谢谢！
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1楼 2020-09-14 13:47:13
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junjieshao

禁虫 (小有名气)
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3楼2020-10-03 04:18:27
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zhouxfd

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

请研究endonuclease和restriction enzyme之间的差别
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2楼2020-09-23 09:24:43
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fuyuandj86

版主 (著名写手)

己所不欲，勿施于人

【答案】应助回帖

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辛辰昊: 金币+35, ★★★很有帮助 2020-10-09 13:49:45
1.一般咱用的大肠杆菌(比如DH5a)是经过改造的，其内部核酸酶活性都比较低。
2.正常情况下大肠杆菌中的内源核酸酶也是在降解质粒的，但是降解的速度较慢，也远赶不上质粒复制扩增的速度。裂解以后核酸酶被释放出来更容易降解质粒。
3.甲基化修饰确实可以影响某些核酸酶，但是不是所有的都会受其影响。
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The doer of good becomes good, the doer of evil becomes evil.
4楼2020-10-04 13:31:29
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diy患者

铁虫 (正式写手)
一般不会，碱裂解法的氢氧化钠会把各种蛋白变性，导致DNA酶失活。但RNA比较强悍，还会有些活性。溶解DNA的TE和溶液一里还有EDTA，也可以防止微量DNA酶的活性。
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5楼2020-10-05 09:27:27
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