[交流] 一种细胞支原体污染快检方法介绍 已有1人参与

作为一个基础医学科研狗，最头疼的莫过于细胞污染，真菌、细菌污染还好说操作得当就可以避免，而且显微镜下容易观察到，最恶心的要数支原体污染，污染之后细胞还能生长，观察不出什么异样，但是实验数据往往无法重复，严重影响实验结果。     现在市场上有一些可以清除支原体的试剂，说实话我是不会用的，清除彻不彻底不说，对实验有啥影响也不好说。检测到污染的细胞，一个字——扔。检测支原体污染也是一道繁琐的工序，试想每批细胞都得检测一次，检测一次花一天功夫。后来网上查到一种革命性的细胞污染支原体检测试剂盒，每次检测只需半个小时，给我减少了很多工作量，这么好用的东西当然要分享安利一波。     这种支原体检测试剂盒是由我国苏州先达基因公司（www.gendx.cn）研发的，其原理是基于该公司自主开发的实时荧光恒温核酸检测技术（ERA），可以在恒定的低温下（25℃-42℃）对痕量的支原体种内保守性DNA片段进行特异性的扩增，扩增反应可以在20min内完成，该试剂盒检测范围涵盖130种支原体。     ERA核酸扩增技术的核心是一套等温核酸扩增组合酶制剂。通过酶工程改造，将来源于细菌和病毒的特定工具酶进行改造突变并筛选其功能，通过不同的DNA扩增反应体系进行优化组合，从而获得多种酶蛋白为核心的等温扩增体系。配好的反应体系在各种实时荧光定量仪或者该公司自主研发的简易恒温荧光检测仪中，可实现恒温扩增与荧光信号检测于一体，通过实时荧光扩增曲线在20min内就可通过检测仪的显示屏读出检测结果，检测过程无需开盖，避免气溶胶的产生，结果可靠性大幅度提高。ERA结合该公司提供的一步法提取DNA的试剂，进一步简化了支原体检测操作，5min完成细胞液的DNA提取，20min完成支原体DNA分子检测，整个过程只需30min。     细胞培养是生命科学研究、生物制药、临床细胞治疗等领域最核心的环节，但是细胞在培养过程中极易受到污染，其中支原体污染是最普遍的污染源，污染细胞的平均比例为30-60%，有些国家甚至高达80-90%。支原体污染的细胞生长缓慢、细胞变形、碎片增加、悬浮细胞容易成团、培养基提前变色，进而导致细胞实验无法重复，生物制药中产品不合格，细胞治疗效果失效甚至进一步危害病人健康。     支原体是生物体中最小的无细胞壁的原核细胞，直径约为0.2-0.3 um，可以通过常用的除菌滤膜(0.22-0.45um)，导致细胞培养中很难避免支原体的污染，而且无法通过普通显微镜观察到，由于无细胞壁普通的抗生素对它根本不起作用。     从2013年开始，《Nature》期刊已正式要求涉及细胞培养的投稿文章，要求必须进行支原体检测，截止目前，大量的SCI期刊都跟进这项要求。为了提高动物细胞培养生物制品的质量和安全性，中华人民共和国药典规定主细胞库、工作细胞库、病毒种子批、对照细胞以及临床治疗用细胞应进行支原体检测。美国食品药品监督管理局(FDA)规定，应该用合适的方法检测细胞的支原体污染状况。欧洲药典规定对细胞治疗产品需要进行严格的支原体检测。     以上这些要求和规定，再加上支原体的特性和污染的后果都指向一点——支原体分子检测成为细胞培养必不可少的环节。     到目前为止，出现了各种各样的支原体检测方法，包括培养法，DNA荧光染色法，电子显微镜法、相差显微镜检测法、3-H胸腺嘧啶掺入法、ELISA法、PCR（qPCR）法等等，但是这些方法或是因为敏感性差容易出现假阴性结果，或是因为检测范围小不能检测到所有的支原体污染，或是因为试验周期长费时费力。如今先达基因研发的基于其ERA技术的支原体检测试剂盒可以克服以上提到的所有问题，使支原体检测如此简单准确。

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