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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » PCR扩增目的条带很淡，杂带也很多，目的条带和接近杂带不好分开，怎么弄啊
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fyn512045

新虫 (初入文坛)

[交流] PCR扩增目的条带很淡，杂带也很多，目的条带和接近杂带不好分开，怎么弄啊

请教各位高手，我的兼并引物PCR扩增，目的条带很淡，非特异性杂带也很多，怎么办？目的条带和接近杂带看上去连着，不好分开，又怎么弄啊？先谢谢大家了

[ Last edited by 350784478 on 2009-7-19 at 11:54 ]
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1楼 2009-07-19 10:30:28
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brightfuture01

木虫之王 (文坛精英)

我爱打老虎

文献杰出贡献
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
引用回帖:
Originally posted by fyn512045 at 2009-7-19 10:30:
请教各位高手，我的兼并引物PCR扩增，目的条带很淡，非特异性杂带也很多，怎么办？目的条带和接近杂带看上去连着，不好分开，又怎么弄啊？先谢谢大家了

[ Last edited by 350784478 on 2009-7-19 at 11:54 ]

你作的是 简并PCR,产物出现多条带再正常不过了,你要回收和你目的条带大小相近的产物,克隆到TA载体上测序.你使用TD PCR试试看.

一定要想办法分开目的条带和杂带.可以通过做大板胶延长电泳时间的方法试试.
赞一下(1人) 回复此楼
The world is a fine place and worth fighting for. I agree with the second part.
8楼2009-07-28 11:52:28
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houjinglhy

荣誉版主 (文坛精英)

表达自由，人权之基。

优秀版主
★
司马诸葛(金币+1,VIP+0):谢谢交流 7-19 15:00
改善下条件，提高退火温度 看看能减少非特异性扩增不
换个浓度的胶跑电泳 看能把它们分开不
如果实在不行的 大不了把目的条带附近的杂带也回收 一起克隆转化
测序的时候多拿几个克隆去测序
赞一下(6人) 回复此楼
从小就学习鲁迅，直到现在才体会到他当时是多么的绝望和无助，却仍要用尽最后一丝力气声嘶力竭的呐喊！
2楼2009-07-19 10:48:46
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第十一维

新虫 (初入文坛)
热启动一下啊，我遇到过类似的事情，热启动不错啊
赞一下 回复此楼
讲学习进行到底
4楼2009-07-27 16:45:46
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hyde0706

木虫 (正式写手)
首先分析你的引物，在模板上是否有错粘。其次确定你的模板比较纯净。然后就是PCR条件的优化，包括镁离子和程序等等。可以考虑加一些增强剂，甘油啊，BSA什么的。
赞一下 回复此楼
5楼2009-07-28 10:59:20
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