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fyn512045

新虫 (初入文坛)

[交流] PCR扩增目的条带很淡,杂带也很多,目的条带和接近杂带不好分开,怎么弄啊

请教各位高手,我的兼并引物PCR扩增,目的条带很淡,非特异性杂带也很多,怎么办?目的条带和接近杂带看上去连着,不好分开,又怎么弄啊?先谢谢大家了

[ Last edited by 350784478 on 2009-7-19 at 11:54 ]
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houjinglhy

荣誉版主 (文坛精英)

表达自由,人权之基。

优秀版主


司马诸葛(金币+1,VIP+0):谢谢交流 7-19 15:00
改善下条件,提高退火温度 看看能减少非特异性扩增不
换个浓度的胶跑电泳 看能把它们分开不
如果实在不行的 大不了把目的条带附近的杂带也回收 一起克隆转化
测序的时候多拿几个克隆去测序
从小就学习鲁迅,直到现在才体会到他当时是多么的绝望和无助,却仍要用尽最后一丝力气声嘶力竭的呐喊!
2楼2009-07-19 10:48:46
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syn1985

木虫 (正式写手)

提高退火温度
3楼2009-07-27 16:35:03
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第十一维

新虫 (初入文坛)

热启动一下啊,我遇到过类似的事情,热启动不错啊
讲学习进行到底
4楼2009-07-27 16:45:46
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hyde0706

木虫 (正式写手)

首先分析你的引物,在模板上是否有错粘。其次确定你的模板比较纯净。然后就是PCR条件的优化,包括镁离子和程序等等。可以考虑加一些增强剂,甘油啊,BSA什么的。
5楼2009-07-28 10:59:20
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rainbamboo8707

金虫 (小有名气)

同意2楼
6楼2009-07-28 11:01:50
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三磷酸腺苷

铁杆木虫 (职业作家)


小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
重新设计引物,其他怎么改善都是治标不治本
7楼2009-07-28 11:09:59
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brightfuture01

木虫之王 (文坛精英)

我爱打老虎

文献杰出贡献


小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
引用回帖:
Originally posted by fyn512045 at 2009-7-19 10:30:
请教各位高手,我的兼并引物PCR扩增,目的条带很淡,非特异性杂带也很多,怎么办?目的条带和接近杂带看上去连着,不好分开,又怎么弄啊?先谢谢大家了

[ Last edited by 350784478 on 2009-7-19 at 11:54 ]

你作的是 简并PCR,产物出现多条带再正常不过了,你要回收和你目的条带大小相近的产物,克隆到TA载体上测序.你使用TD PCR试试看.

一定要想办法分开目的条带和杂带.可以通过做大板胶延长电泳时间的方法试试.
The world is a fine place and worth fighting for. I agree with the second part.
8楼2009-07-28 11:52:28
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