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TEV酶切mbp标签蛋白，切不开
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如题，蛋白变性复性以后依然切不开 @gyesang 发自小木虫Android客户端 |
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基因是让别人合成的，反馈报告没问题，中间也有了解linker.我是先在6M盐酸胍中透析变性，再透析复性，全程没有沉淀。我怎么知道我的蛋白复性成功没？像我现在这样，还有什么可以去尝试的？谢谢 发自小木虫Android客户端 |
5楼2020-08-21 17:46:48
zsygxh
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1 首先确认一下TEV的酶切位点有没有突变或其它问题 2 确认一下是真的复性成功了还是只是形成了可溶性聚集体或其它非正确构象的状态？有测活性吗？有活性的话，有跑HPLC看一下是否是一个均一峰吗？ 3 确认一下酶切溶液是否合适 4 以上都没问题的话，可能是你的蛋白折叠后影响了酶切序列的暴露，由于存在空间位阻，TEV不能识别。可以查查这个蛋白的结构有没有人解出来，有的话可以看看N端的空间结构。 发自小木虫Android客户端 |
2楼2020-08-20 14:35:18
3楼2020-08-21 13:30:38
zsygxh
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商业化的酶，按说明书的条件切的，默认酶切体系没问题，没切出来，那么大概率是你的蛋白的问题了。TEV识别的位点是ENLYFQG，切在Q-G之间。几种可能性： 1. 载体上TEV识别的酶切序列发生突变，导致不能识别。建议：测序验证一下； 2. TEV酶切位点序列正确，但是存在空间位阻，分两种情况： 2.1 蛋白结构正确：酶切位点前面的MBP标签和后面连的目的蛋白的空间结构影响了酶切位点的暴露，使TEV无法接触识别。建议：可以尝试在酶切位点与标签之间添加Linker，拉长位点与MBP的距离。 2.2 最大的可能性，蛋白没有复性成功，碰到好多人都误以为蛋白从沉淀转变为可溶性溶液状态就是复性成功了，实际上复性远没那么简单。可溶性状态可以是可溶性聚集体，也可以是多种不同构象的混合物，实现这种转变太简单了，但要将其结构归一成完全正确的构象那才是最困难的，所以怀疑你的蛋白没有折叠成功，而结构不对又影响了酶切位点的暴露，导致切不开。 |
4楼2020-08-21 17:02:55