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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 蛋白/酶 » TEV酶切mbp标签蛋白，切不开
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~沙~

新虫 (初入文坛)

[求助] TEV酶切mbp标签蛋白，切不开

如题，蛋白变性复性以后依然切不开

@gyesang 发自小木虫Android客户端
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1楼 2020-08-19 14:42:14
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zsygxh

金虫 (小有名气)
1 首先确认一下TEV的酶切位点有没有突变或其它问题
2 确认一下是真的复性成功了还是只是形成了可溶性聚集体或其它非正确构象的状态？有测活性吗？有活性的话，有跑HPLC看一下是否是一个均一峰吗？
3 确认一下酶切溶液是否合适
4 以上都没问题的话，可能是你的蛋白折叠后影响了酶切序列的暴露，由于存在空间位阻，TEV不能识别。可以查查这个蛋白的结构有没有人解出来，有的话可以看看N端的空间结构。

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2楼2020-08-20 14:35:18
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~沙~

新虫 (初入文坛)
由于实验条件有限没有测，填料和TEV酶都是买的NEB的！按照说明书来的。

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3楼2020-08-21 13:30:38
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zsygxh

金虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by ~沙~ at 2020-08-21 13:30:38
由于实验条件有限没有测，填料和TEV酶都是买的NEB的！按照说明书来的。

商业化的酶，按说明书的条件切的，默认酶切体系没问题，没切出来，那么大概率是你的蛋白的问题了。TEV识别的位点是ENLYFQG，切在Q-G之间。几种可能性：
1. 载体上TEV识别的酶切序列发生突变，导致不能识别。建议：测序验证一下；
2. TEV酶切位点序列正确，但是存在空间位阻，分两种情况：
   2.1 蛋白结构正确：酶切位点前面的MBP标签和后面连的目的蛋白的空间结构影响了酶切位点的暴露，使TEV无法接触识别。建议：可以尝试在酶切位点与标签之间添加Linker，拉长位点与MBP的距离。
   2.2 最大的可能性，蛋白没有复性成功，碰到好多人都误以为蛋白从沉淀转变为可溶性溶液状态就是复性成功了，实际上复性远没那么简单。可溶性状态可以是可溶性聚集体，也可以是多种不同构象的混合物，实现这种转变太简单了，但要将其结构归一成完全正确的构象那才是最困难的，所以怀疑你的蛋白没有折叠成功，而结构不对又影响了酶切位点的暴露，导致切不开。
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4楼2020-08-21 17:02:55
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~沙~

新虫 (初入文坛)
基因是让别人合成的，反馈报告没问题，中间也有了解linker.我是先在6M盐酸胍中透析变性，再透析复性，全程没有沉淀。我怎么知道我的蛋白复性成功没？像我现在这样，还有什么可以去尝试的？谢谢

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5楼2020-08-21 17:46:48
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zsygxh

金虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by ~沙~ at 2020-08-21 17:46:48
基因是让别人合成的，反馈报告没问题，中间也有了解linker.我是先在6M盐酸胍中透析变性，再透析复性，全程没有沉淀。我怎么知道我的蛋白复性成功没？像我现在这样，还有什么可以去尝试的？谢谢
...

有条件的话，拿透析后酶切前的样品和盐酸胍+还原剂彻底变性的样品分别跑一下反相，比较一下出峰位置以及峰形，通常蛋白折叠后疏水侧链折入分子内部，亲水性增强，在反相上出峰位置会提前，如果透析后样品能跑出较明显的均一峰，那么有可能这个峰是复性成功的部分（也可能不是），但如果跑出来的峰没有主峰，很杂乱，那么应该是复性失败了，形成了众多可溶性的杂乱构象及其聚集体。

如果有合适Maker的话，也可以跑一下Native-PAGE，看看是不是聚集体。如果目的蛋白含较多Cys，也可以尝试跑还原-非还原电泳，看看是不是二硫键错配产生的聚集体。有分子筛的话也可以跑一下看看有没有聚集体。

如果没复性成功，那只能根据蛋白性质摸方法，复性跟其它东西不一样，没有什么好的套路，只能根据蛋白的性质去相应设计复性条件，这个是没办法给你提供建议的。只能建议你分析一下一级序列，然后设计一些实验去了解你蛋白的性质，分析它为什么会形成包涵体，然后反其道而行之，使用合适的方法、试剂对症下药进行优化。
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6楼2020-08-22 17:20:07
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小小云er呀

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by zsygxh at 2020-08-21 17:02:55
商业化的酶，按说明书的条件切的，默认酶切体系没问题，没切出来，那么大概率是你的蛋白的问题了。TEV识别的位点是ENLYFQG，切在Q-G之间。几种可能性：
1. 载体上TEV识别的酶切序列发生突变，导致不能识别。建议： ...

您好！请问在标签和酶切位点之间添加linker的话是添加什么linker呢？
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7楼2024-07-25 12:25:47
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