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黑七泷胶庄

新虫 (初入文坛)

确定同源臂设计没问题吗,连不起来很大部分原因是你的同源臂设计不合理

发自小木虫Android客户端
11楼2020-08-20 22:43:57
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BioChen

银虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

实验结果阴性,考虑做阳性对照。

1. 第一个阳性对照,PCR一个短片段(500-1000bp即可),接口酶依然是ecor1和hind3,连接载体依然是petduet-1,如果能连接不成功,说明你整个酶切/连接/转化体系可能有问题。

2. 大片段连接和转化的存在效率问题,你的片段+载体都有9K多了。建议你做一个对照,3900bp的片段 连 T载体(这个长度可能会有连接效率的问题,转化效率不存在瓶颈),如果连接不成功,说明你现在的连接体系对于大片段的效率非常低。如果成功了,你的片段以后就不许需要通过PCR制备了,也会后续的步骤省力。

3. 9K的质粒,热转如果效率不高,考虑换感受态,或者电转。这个要看你自己实验室的技术了,当然也有人会告诉你,9k的质粒一点也不大。

4. 我从来都是不算连接比例的,片段绝对是超量的,就算片段自连也长不出菌。
12楼2020-08-22 08:42:07
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