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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 综合其他 » 基因全长老是P不出来怎么办
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匿名

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1楼 2020-08-11 16:36:21
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fengqingrusi

金虫 (著名写手)

超大个甲壳虫
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
P不出来全长基因有多方面的原因。
首先需要考虑的是引物设计。对于比较长的基因，引物设计可以多试几对（一般设计3～4对，如果自己设计有困难可以考虑招公司帮忙设计），引物长度也可以考虑设计长一点（一般不超过35bp）；
其次需要考虑的是用来做模版的cDNA质量。模版cDNA的质量决定了你能不能最终拿到目的基因；有一些基因的表达量在不同细胞里面表达量不同，可以考虑找一个表达量高的细胞来提取RNA，然后做反转录得到模版cDNA，然后再去PCR；
再次就是PCR所使用的酶。对于长片段而言，也许需要用保真度高的PCR酶，我之前用过NEB公司的高保真酶，效果不错；如果PCR得到是有错误序列的片段，可以考虑换酶；如果是P到的是其他的片段，有可能是因为模版或者引物设计的问题；
最后需要考虑的是优化PCR的程序。这个需要自己慢慢去摸索，每个基因有一些特定的程序，我曾经P过3k、4k的片段，也是摸索了很长时间。退火温度、延伸时间以及循环数都是要摸索和优化的。PCR是一门很大的学问，能做好PCR实验，基本上就爬过了生物学实验的第一座大山，其他的实验会就会相对简单一些。最后祝实验顺利！
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北海myth
海纳百川有容乃大，壁立千仞无欲则刚。
5楼2020-08-27 15:54:29
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jurkat.1640

至尊木虫 (文坛精英)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
Takara PS-GXL比较好用
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2楼2020-08-17 16:24:51
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犹怜草木青

木虫 (职业作家)

热心群众铁柱儿
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引物设计长一些，降低退火温度，换酶，南京诺唯赞的高保真酶还是很厉害的～要不要试试？

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铁柱儿是个温柔的姐姐
4楼2020-08-23 15:03:56
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wangyuan0929

金虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by fengqingrusi at 2020-08-27 15:54:29
P不出来全长基因有多方面的原因。
首先需要考虑的是引物设计。对于比较长的基因，引物设计可以多试几对（一般设计3～4对，如果自己设计有困难可以考虑招公司帮忙设计），引物长度也可以考虑设计长一点（一般不超过 ...

NEB的酶，有钱人
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6楼2020-08-27 16:53:54
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