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匿名

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jurkat.1640

至尊木虫 (文坛精英)


小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
Takara PS-GXL比较好用
2楼2020-08-17 16:24:51
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junjieshao

禁虫 (小有名气)

本帖内容被屏蔽

3楼2020-08-22 01:35:27
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犹怜草木青

木虫 (职业作家)

热心群众铁柱儿


小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
引物设计长一些,降低退火温度,换酶,南京诺唯赞的高保真酶还是很厉害的~要不要试试?

发自小木虫Android客户端
铁柱儿是个温柔的姐姐
4楼2020-08-23 15:03:56
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fengqingrusi

金虫 (著名写手)

超大个甲壳虫


小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
P不出来全长基因有多方面的原因。
首先需要考虑的是引物设计。对于比较长的基因,引物设计可以多试几对(一般设计3~4对,如果自己设计有困难可以考虑招公司帮忙设计),引物长度也可以考虑设计长一点(一般不超过35bp);
其次需要考虑的是用来做模版的cDNA质量。模版cDNA的质量决定了你能不能最终拿到目的基因;有一些基因的表达量在不同细胞里面表达量不同,可以考虑找一个表达量高的细胞来提取RNA,然后做反转录得到模版cDNA,然后再去PCR;
再次就是PCR所使用的酶。对于长片段而言,也许需要用保真度高的PCR酶,我之前用过NEB公司的高保真酶,效果不错;如果PCR得到是有错误序列的片段,可以考虑换酶;如果是P到的是其他的片段,有可能是因为模版或者引物设计的问题;
最后需要考虑的是优化PCR的程序。这个需要自己慢慢去摸索,每个基因有一些特定的程序,我曾经P过3k、4k的片段,也是摸索了很长时间。退火温度、延伸时间以及循环数都是要摸索和优化的。PCR是一门很大的学问,能做好PCR实验,基本上就爬过了生物学实验的第一座大山,其他的实验会就会相对简单一些。最后祝实验顺利!

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海纳百川有容乃大,壁立千仞无欲则刚。
5楼2020-08-27 15:54:29
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wangyuan0929

金虫 (小有名气)

引用回帖:
5楼: Originally posted by fengqingrusi at 2020-08-27 15:54:29
P不出来全长基因有多方面的原因。
首先需要考虑的是引物设计。对于比较长的基因,引物设计可以多试几对(一般设计3~4对,如果自己设计有困难可以考虑招公司帮忙设计),引物长度也可以考虑设计长一点(一般不超过 ...

NEB的酶,有钱人
6楼2020-08-27 16:53:54
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匿名

送红花一朵
本帖仅楼主可见
7楼2020-11-23 20:57:19
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