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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » QPCR的问题
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My-life

捐助贵宾 (小有名气)

[求助] QPCR的问题 已有1人参与

在做QPCR（sybr green）时一直没有扩增曲线（就是一条直线），图为溶解曲线的图和程序参数。
扩增片段为cgc att cag gat tgc atg att gcc tcg tct taa cgg tct caa ctc gta（此片段为设计合成）
上下游引物为ttc agg att gca tga ttg cc和acg agt tga gac cgt taa gac g
20μL体积，1μL模板（10μM），1μL（10μM）上游引物和1μL（10μM）下游引物，10μL supermix液，8μL的纯水。
所以在此向大神们请教几个问题：1，单链模板可以直接PCR？
2，试剂盒supermix影响大？
3，影响QPCR的关键点是啥？
小白一枚，之前一直从事酶联免疫的分析检测，未涉及PCR实验，初接触，无处下手了！！！

QPCR的问题
305889642721921794.jpg


QPCR的问题-1
790287839903650680.jpg
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1楼 2020-07-11 21:06:06
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魔里纱

新虫 (初入文坛)
可能是没有设采集信号吧...

发自小木虫IOS客户端
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2楼2020-07-11 21:55:57
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owl2010

金虫 (正式写手)
没搞清楚你的模板是什么？如果模板是单链是不能扩增出片段的。做qPCR之前可以做常规PCR检测一下是不是能扩增出条带。没有条带说明引物不行或者模板不行。
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男人的组成要素:金钱、面子、性、怕死、自恋、吹牛逼。
3楼2020-07-14 13:26:56
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匿名

用户注销 (小有名气)
本帖仅楼主可见
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4楼2020-07-14 14:58:18
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My-life

捐助贵宾 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by owl2010 at 2020-07-14 13:26:56
没搞清楚你的模板是什么？如果模板是单链是不能扩增出片段的。做qPCR之前可以做常规PCR检测一下是不是能扩增出条带。没有条带说明引物不行或者模板不行。

任何单链都无法扩增？
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5楼2020-07-20 15:03:29
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A奇点

新虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by owl2010 at 2020-07-14 13:26:56
没搞清楚你的模板是什么？如果模板是单链是不能扩增出片段的。做qPCR之前可以做常规PCR检测一下是不是能扩增出条带。没有条带说明引物不行或者模板不行。

如何做常规PCR啊？我的qPCR做出来，内参基因和目的基因的ct值都在31左右，太痛苦了

发自小木虫Android客户端
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6楼2020-07-21 23:00:25
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duanbiao127

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

单链可以扩增，cDNA都是单链，是可以扩增的，不要听楼上的乱说。（关注生物技术控公众号，有问题可留言）
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7楼2020-08-12 10:57:28
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