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请教师兄师姐一个问题 已有3人参与
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各位师兄师姐，我目前在做重组蛋白的原核表达，有一个问题想请教各位，具体是这样的： 我有两个蛋白，给其中一个蛋白的C-融合了荧光蛋白GFP，而给另一个蛋白的C-融合了荧光蛋白C-mScarlet 我先将含有两个融合蛋白的编码序列分别整合到质粒 pET28a和pET21a中。 随后，我将两个质粒分别转化到BL21细胞中，37度过夜培养后有不少菌落我将它拿了出来，之后在室温下放了一个周末。 今天我发现菌落长大了，仔细一看两个平板上的菌落分别带有淡淡的绿色和淡淡的粉色，于是我认为我的目的蛋白应该能很好表达，便非常高兴。可是我转眼一想又有些困惑，不是说加了IPTG才能诱导蛋白的表达吗？可是平板上是肯定没有加IPTG的。说能告诉我这是为什么？非常感谢！ |
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ECUST_CAPF
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- 专业: 生物大分子结构与功能
4楼2020-04-28 10:37:26
ECUST_CAPF
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2楼2020-04-28 10:29:53
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小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
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先了解IPTG的诱导原理，我们再分析你这个实验的进程发展 基础知识解析: 1. IPTG：异丙基硫代半乳糖苷，诱导剂，不被细菌代谢，十分稳定 2. BL21是大肠杆菌中用于高效表达菌株，适合表达非毒性蛋白，可转化含有噬菌体T7启动子的表达载体，位于λ噬菌体DE3区的T7噬菌体RNA聚合酶整合于B21染色体上，RNA聚合酶表 达后可高效结合于T7promoter，促进外源质粒的表达 背景原理： 大肠杆菌乳糖操纵子基因含有I（阻遏基因）P（启动子）O（操纵子），结构基因lacZ、lacY、lacA，分别表达β半乳糖苷酶、通透酶、乙酰基转移酶 正常情况下在没有乳糖存在时，lac操纵子（元）处于阻遏状态，Lac阻遏物能与操纵基因O结合，阻碍RNA聚合酶与P序列结合，抑制转录起动。而当有诱导剂与阻遏蛋白结合后， 其蛋白构象就发生变化，导致阻遏物从操纵基因O上解离下来，RNA聚合酶不再受阻碍，发生转录。 分析你的实验： 原核诱导表达，GFP绿色荧光，mScarlet猩红色，着两种标记光色，少量需激发光下可查看，大量积累才可肉眼观察到 按照理论分析是不会有目的蛋白产物累计，实际上会有一部分 建议： 在培养0小时收取，24h、48h、72h.。。。。。持续收获5-7天，跑胶，考马斯亮蓝着色，查看目的位置的蛋白积累量变化 同时做IPTG，诱导，重复上述步骤，两两对比即可 |
3楼2020-04-28 10:30:31
5楼2020-04-28 10:45:15