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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 层析/纯化 » 请教师兄师姐一个问题
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曾在，天涯

新虫 (小有名气)

[交流] 请教师兄师姐一个问题 已有3人参与

各位师兄师姐，我目前在做重组蛋白的原核表达，有一个问题想请教各位，具体是这样的：
我有两个蛋白，给其中一个蛋白的C-融合了荧光蛋白GFP，而给另一个蛋白的C-融合了荧光蛋白C-mScarlet
我先将含有两个融合蛋白的编码序列分别整合到质粒 pET28a和pET21a中。
随后，我将两个质粒分别转化到BL21细胞中，37度过夜培养后有不少菌落我将它拿了出来，之后在室温下放了一个周末。
今天我发现菌落长大了，仔细一看两个平板上的菌落分别带有淡淡的绿色和淡淡的粉色，于是我认为我的目的蛋白应该能很好表达，便非常高兴。可是我转眼一想又有些困惑，不是说加了IPTG才能诱导蛋白的表达吗？可是平板上是肯定没有加IPTG的。说能告诉我这是为什么？非常感谢！
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1楼 2020-04-28 08:59:55
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ECUST_CAPF

铜虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
注意一下你的培养基成分来源，有的是含有乳糖成分的，我们以前也发现你的问题，后来才发现是这个原因，换成无乳糖成分的之后就好了
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Behind the glory is a loneliness
2楼2020-04-28 10:29:53
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博士苑

新虫 (初入文坛)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
先了解IPTG的诱导原理，我们再分析你这个实验的进程发展


基础知识解析:

1. IPTG：异丙基硫代半乳糖苷，诱导剂，不被细菌代谢，十分稳定

2. BL21是大肠杆菌中用于高效表达菌株，适合表达非毒性蛋白，可转化含有噬菌体T7启动子的表达载体，位于λ噬菌体DE3区的T7噬菌体RNA聚合酶整合于B21染色体上，RNA聚合酶表

达后可高效结合于T7promoter，促进外源质粒的表达

背景原理：

大肠杆菌乳糖操纵子基因含有I（阻遏基因）P（启动子）O（操纵子），结构基因lacZ、lacY、lacA，分别表达β半乳糖苷酶、通透酶、乙酰基转移酶

正常情况下在没有乳糖存在时，lac操纵子（元）处于阻遏状态，Lac阻遏物能与操纵基因O结合，阻碍RNA聚合酶与P序列结合，抑制转录起动。而当有诱导剂与阻遏蛋白结合后，

其蛋白构象就发生变化，导致阻遏物从操纵基因O上解离下来，RNA聚合酶不再受阻碍，发生转录。

分析你的实验：

原核诱导表达，GFP绿色荧光，mScarlet猩红色，着两种标记光色，少量需激发光下可查看，大量积累才可肉眼观察到

按照理论分析是不会有目的蛋白产物累计，实际上会有一部分

建议：

在培养0小时收取，24h、48h、72h.。。。。。持续收获5-7天，跑胶，考马斯亮蓝着色，查看目的位置的蛋白积累量变化

同时做IPTG，诱导，重复上述步骤，两两对比即可
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3楼2020-04-28 10:30:31
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ECUST_CAPF

铜虫 (小有名气)
★
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引用回帖:
3楼: Originally posted by 博士苑 at 2020-04-28 10:30:31
先了解IPTG的诱导原理，我们再分析你这个实验的进程发展


基础知识解析:

1. IPTG：异丙基硫代半乳糖苷，诱导剂，不被细菌代谢，十分稳定

2. BL21是大肠杆菌中用于高效表达菌株，适合表达非毒性蛋白，可转 ...

一节生动的分子生物学课展现在面前
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Behind the glory is a loneliness
4楼2020-04-28 10:37:26
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曾在，天涯

新虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by ECUST_CAPF at 2020-04-28 10:29:53
注意一下你的培养基成分来源，有的是含有乳糖成分的，我们以前也发现你的问题，后来才发现是这个原因，换成无乳糖成分的之后就好了

谢谢你的回帖，我们用的培养基是普通的LB +agar。你们之前用的什么培养基？谢谢！

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5楼2020-04-28 10:45:15
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曾在，天涯

新虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by ECUST_CAPF at 2020-04-28 10:37:26
一节生动的分子生物学课展现在面前...

谢谢大博士科普。

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6楼2020-04-28 10:45:44
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ECUST_CAPF

铜虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
5楼: Originally posted by 曾在，天涯 at 2020-04-28 10:45:15
谢谢你的回帖，我们用的培养基是普通的LB +agar。你们之前用的什么培养基？谢谢！
...

你要问一下LB中有没有乳糖来源，我们之前用的青岛生工的LB  ， 其中的tryptone来源是啥来着我忘了，但是含有乳糖的，后来让他们给我们供应的牛骨来源的tryptone，就不含乳糖，这种自表达现象就结束了
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Behind the glory is a loneliness
7楼2020-04-28 11:31:06
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曾在，天涯

新虫 (小有名气)
谢谢大家的指点！
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8楼2020-04-28 13:28:24
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melyliang

新虫 (正式写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
有的时候存在泄露表达，调控不严谨

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9楼2020-07-09 23:56:24
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