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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » RNA Probe 制备的问题
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xutao

金虫 (著名写手)

第三军团总参谋

[交流] RNA Probe 制备的问题

各位大侠，小弟最近在做RNA probe，每次线性完质粒DNA，回收线性DNA时，回收率很低，这样做模版时得到的探针会很有限。
请教谁有做探针的经验，指导一下。
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第三军团
1楼 2009-07-06 22:09:23
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xutao

金虫 (著名写手)

第三军团总参谋
没人知道吗？自己顶下,再顶下

[ Last edited by xutao on 2009-7-7 at 13:02 ]
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第三军团
2楼2009-07-06 22:22:57
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zplipeng
3楼2009-07-06 23:23:29
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xutao

金虫 (著名写手)

第三军团总参谋
？？？？
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第三军团
4楼2009-07-07 13:02:44
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hyf9901

铁杆木虫 (著名写手)
★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
xutao(金币+5,VIP+0):200ul体系？我用我们老板的体系，都只有20ul。我就是纯化模版的时候老是回收率很低！如果可以的话，能把你的protocol发给我吗？谢谢！ 7-7 18:08
xutao(金币+2,VIP+0): 7-7 18:08
说的再详细些

最好用试剂盒制备探针，我们一般用Roche的或sigma的

质粒DNA一般用试剂盒的柱子（如天根，博大泰克，华舜等）回收，确保高产优质，

200uL酶切体系37度过夜，酶切的量自己把握，最好提前测一些酶切了多少微克的质

粒，按照回收流程操作，一般回收效率50到70%
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滴自己的汗，吃自己的饭，自己的事情自己办，不抱怨，不诉苦，走一步，是一步，一路朝前不回头，死到哪站算哪站
5楼2009-07-07 13:33:05
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xiaoyuyf

新虫 (初入文坛)
★ ★ ★
xutao(金币+3,VIP+0):能把您的protoco发给我吗？ 7-7 18:09
用Roche的盒子标的探针，其实有roche的RNA纯化的柱子，这样可以得到较高的探针的回收率。质粒要是怕回收效率不高的话，可以多提取些，多酶切点就可以了。
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6楼2009-07-07 14:39:47
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hyf9901

铁杆木虫 (著名写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
http://my.muchong.com/space.php?uid=256775&do=blog&id=104548
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滴自己的汗，吃自己的饭，自己的事情自己办，不抱怨，不诉苦，走一步，是一步，一路朝前不回头，死到哪站算哪站
7楼2009-07-07 18:51:08
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xutao

金虫 (著名写手)

第三军团总参谋
引用回帖:
Originally posted by hyf9901 at 2009-7-7 18:51:
http://my.muchong.com/space.php?uid=256775&do=blog&id=104548

谢谢了
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第三军团
8楼2009-07-07 18:56:56
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hyf9901

铁杆木虫 (著名写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
酶切体系不是关键，关键是先制备高纯度的质粒，然后确保质粒酶切完全，一般37度酶切过夜效果很好，我常用200ul体系酶切2-4ug质粒，酶切后取出5-6ul电泳确保线性化彻底，不然后续反转录时容易转录出载体上的序列，但是即使这样一般也不影响杂交结果，应为杂交的一般式目的基因，与载体序列很少有较高的同源性，呵呵

你老板怎么做的啊，可以请教他啊
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滴自己的汗，吃自己的饭，自己的事情自己办，不抱怨，不诉苦，走一步，是一步，一路朝前不回头，死到哪站算哪站
9楼2009-07-07 19:01:28
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xutao

金虫 (著名写手)

第三军团总参谋
引用回帖:
Originally posted by hyf9901 at 2009-7-7 19:01:
酶切体系不是关键，关键是先制备高纯度的质粒，然后确保质粒酶切完全，一般37度酶切过夜效果很好，我常用200ul体系酶切2-4ug质粒，酶切后取出5-6ul电泳确保线性化彻底，不然后续反转录时容易转录出载体上的序列， ...

他不是做着方面的高手，他以前做的时候，也没有出现过这个问题，他用的20ul的体系，回收之后跑的带还很亮，而我每次都很暗，不知道这影响大不大？我也尝试做了几次，每次都是没有什么特异性。现在都快绝望了
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第三军团
10楼2009-07-07 19:33:30
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