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xutao

金虫 (著名写手)

第三军团总参谋

[交流] RNA Probe 制备的问题

各位大侠,小弟最近在做RNA probe,每次线性完质粒DNA,回收线性DNA时,回收率很低,这样做模版时得到的探针会很有限。
请教谁有做探针的经验,指导一下。
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第三军团
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xutao

金虫 (著名写手)

第三军团总参谋

没人知道吗?自己顶下,再顶下

[ Last edited by xutao on 2009-7-7 at 13:02 ]
第三军团
2楼2009-07-06 22:22:57
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3楼2009-07-06 23:23:29
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xutao

金虫 (著名写手)

第三军团总参谋

????
第三军团
4楼2009-07-07 13:02:44
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hyf9901

铁杆木虫 (著名写手)

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
xutao(金币+5,VIP+0):200ul体系?我用我们老板的体系,都只有20ul。我就是纯化模版的时候老是回收率很低!如果可以的话,能把你的protocol发给我吗?谢谢! 7-7 18:08
xutao(金币+2,VIP+0): 7-7 18:08
说的再详细些

最好用试剂盒制备探针,我们一般用Roche的或sigma的

质粒DNA一般用试剂盒的柱子(如天根,博大泰克,华舜等)回收,确保高产优质,

200uL酶切体系37度过夜,酶切的量自己把握,最好提前测一些酶切了多少微克的质

粒,按照回收流程操作,一般回收效率50到70%
滴自己的汗,吃自己的饭,自己的事情自己办,不抱怨,不诉苦,走一步,是一步,一路朝前不回头,死到哪站算哪站
5楼2009-07-07 13:33:05
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xiaoyuyf

新虫 (初入文坛)

★ ★ ★
xutao(金币+3,VIP+0):能把您的protoco发给我吗? 7-7 18:09
用Roche的盒子标的探针,其实有roche的RNA纯化的柱子,这样可以得到较高的探针的回收率。质粒要是怕回收效率不高的话,可以多提取些,多酶切点就可以了。
6楼2009-07-07 14:39:47
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hyf9901

铁杆木虫 (著名写手)


小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
滴自己的汗,吃自己的饭,自己的事情自己办,不抱怨,不诉苦,走一步,是一步,一路朝前不回头,死到哪站算哪站
7楼2009-07-07 18:51:08
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xutao

金虫 (著名写手)

第三军团总参谋

引用回帖:
Originally posted by hyf9901 at 2009-7-7 18:51:
http://my.muchong.com/space.php?uid=256775&do=blog&id=104548

谢谢了
第三军团
8楼2009-07-07 18:56:56
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hyf9901

铁杆木虫 (著名写手)


小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
酶切体系不是关键,关键是先制备高纯度的质粒,然后确保质粒酶切完全,一般37度酶切过夜效果很好,我常用200ul体系酶切2-4ug质粒,酶切后取出5-6ul电泳确保线性化彻底,不然后续反转录时容易转录出载体上的序列,但是即使这样一般也不影响杂交结果,应为杂交的一般式目的基因,与载体序列很少有较高的同源性,呵呵

你老板怎么做的啊,可以请教他啊
滴自己的汗,吃自己的饭,自己的事情自己办,不抱怨,不诉苦,走一步,是一步,一路朝前不回头,死到哪站算哪站
9楼2009-07-07 19:01:28
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xutao

金虫 (著名写手)

第三军团总参谋

引用回帖:
Originally posted by hyf9901 at 2009-7-7 19:01:
酶切体系不是关键,关键是先制备高纯度的质粒,然后确保质粒酶切完全,一般37度酶切过夜效果很好,我常用200ul体系酶切2-4ug质粒,酶切后取出5-6ul电泳确保线性化彻底,不然后续反转录时容易转录出载体上的序列, ...

他不是做着方面的高手,他以前做的时候,也没有出现过这个问题,他用的20ul的体系,回收之后跑的带还很亮,而我每次都很暗,不知道这影响大不大?我也尝试做了几次,每次都是没有什么特异性。现在都快绝望了
第三军团
10楼2009-07-07 19:33:30
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