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重组杆状病毒感染SF9细胞不表达目的蛋白
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各位同学，最近用重组杆状病毒感染SF9细胞表达蛋白，但是遇到了一些问题请教大家： 重组杆状病毒是由生物公司合成提供的，经qPCR验证含有目的基因片段。 1、SF9细胞28℃震荡培养至1*10^6密度，重组杆状病毒（P3代）按照MOI=0.1、5、20感染细胞。病毒感染SF9细胞以后，与阴性对照相比，细胞病变并不明显，只有一点点变大，但是也不是很明显，但是细胞明显生长变缓，细胞数基本不增加。病毒刚感染细胞和感染培养3天以后分别收获上清经qPCR验证，CT值缩小了10，是否可以确定病毒已经成功感染细胞并且增值？ 2、蛋白是胞内蛋白，感染3天以后离心沉淀经RIP高效裂解液（索莱宝）裂解后进行SDS-PAGE，考马斯染色没有目的蛋白条带。与阳性蛋白（外包公司合成并纯化的蛋白）一起进行WB，ECL显色后，阳性蛋白明显有条带，但是自己做的一点都没有，是否说明蛋白没有表达？ 3、我把MOI做了0.1、5、10、20，SDS-PAGE结果都没有蛋白条带。 4、有没有病毒本身成功感染并增殖，但是不表达蛋白的可能性？如果我要得到表达蛋白，应该如何改进我的实验条件？不表达蛋白的问题可能是什么？谢谢！ |
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2楼2020-04-15 21:11:35
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5楼2020-04-17 16:33:47
6楼2020-04-18 10:31:18
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我之前也遇到了，我用的His标签，PAGE看不到带，WB检测不到条带，后来是换的阳性血清抗体检测才看到条带，不知道你的是不是也是这个问题；对于PAGE看不到带，通过提高病毒滴度，胞内表达的蛋白在破碎后，沉淀可以看到条带，WB检测条带也比较粗，不知道你的是否也存在这个问题 发自小木虫Android客户端 |
7楼2021-01-25 11:05:45
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通过对现有bac-to-bac系统进行改造，获得敲除蛋白酶、敲除p26、p10等蛋白重组系统。并且，在该重组系统加入弱荧光标记及抗凋亡siRNA，可有效指示转染过程、提高抗原表达量（尤其是分泌蛋白及囊膜蛋白）。感兴趣的同志可以留言。 发自小木虫Android客户端 |
8楼2021-05-17 14:41:22
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