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fkbp23

木虫 (小有名气)

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[交流] 急问：有没有哪位虫虫朋友测过ATPase活性？已有4人参与

小女子刚刚开始测ATPase活性，用的方法是NADH，ATP，LDH，PK，PEP coupled spectroscopic assay方法，测NADH在340nm吸光度变化。蛋白量在0.25-0.5uM时时活性正常，可是增大到1uM以后，翻2或3倍后，活性值也不再增大，就像是到了极限似的，与实验室前人1uM的结果相比，还低了30%，十分郁闷，蛋白是新提出来的，应该不会有什么问题，方法都是一样的。不知道有什么方法可以鉴定一下到底是哪里出了问题呢，还请各位高人帮忙！>orz

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1楼2009-07-05 18:20:24

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HarveyWang

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★ ★ ★ ★
fkbp23(金币+1):谢谢参与
fkbp23(金币+3,VIP+0): 7-6 10:37

测定酶活时，就是要做线性曲线，例如你的ATPase，取0.1-1 uM做线性，

看看最高到多少时，反应吸光值就不成线性了，那就不用最高浓度了。

另外，ATPase的提取时，破碎方式和缓冲液微量成份对酶活测定会有影响。
例如夹杂极微量的重金属离子，会明显抑制酶活。
如果真是这样，优化一下自己的提取方法吧。