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新人小玥

木虫 (正式写手)

[交流] 求助:关于PCR产物的连接到入门载体中

请问一下,有没有人知道
怎样可以提高PCR片段连入入门载体pCR8/GW TOPO上的效率?
我的PCR片段是3300左右的大小,使用切胶回收的。

哪位高手可以给我点建议,小女子在这谢过了!!!

[ Last edited by amisking on 2009-8-1 at 16:14 ]
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lynn5180

铜虫 (初入文坛)


小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
我们都是直接连的,做完PCER切胶回收和供体25度反映过夜,第二天加蛋白酶K然后取一半转化,万一不成功再用剩余的一半
2楼2009-07-02 11:15:12
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新人小玥

木虫 (正式写手)

请问您所连的片段有3000多bp吗?
3楼2009-07-02 11:58:10
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dyyyyy

铁杆木虫 (著名写手)

如果是普通taq酶的pcr产物,建议把最后一步72℃延长到15min以上。如果是高保真酶,建议做完pcr后,用普通taq没给pcr产物加A
4楼2009-07-02 12:13:32
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smallcat227

木虫 (著名写手)


小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
连接几小时候可以补加少量连接酶buffer以补充消耗的ATP
5楼2009-07-20 22:17:44
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wangtengxu

木虫 (正式写手)


小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
延长时间以及提高模板质量,有助于提高效率。
想和有趣的人一起做有趣的事。
6楼2009-07-20 22:26:43
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zjwang

木虫 (正式写手)

7楼2009-07-30 18:53:52
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sunqx

木虫 (著名写手)

我觉得增加连接时间,选取好的感受态,可以会好一些
8楼2009-08-01 15:55:40
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