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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » RT-PCR的条带弥散问题（附图）
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gynan123

金虫 (小有名气)

[交流] RT-PCR的条带弥散问题（附图）

总体系25微升
DNTP 各2.5mM 4ul
Mg 25mM  2ul
模板2ul
引物F 0.5ul，R 0.5ul
taq酶 0.25ul
10*buffer 2.5ul
H2O 13.25ul

退火温度59.4度   35个循环。
94度 45秒  59.4度 45秒  72度60秒  
请大家帮我指点一下，我得到的图像很不理想,目的基因弥散很大。
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1楼 2009-07-01 10:48:47
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112976553

金虫 (小有名气)
★
gynan123(金币+1):谢谢参与
帮忙顶一下，看高手来解答
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2楼2009-07-01 10:52:48
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三磷酸腺苷

铁杆木虫 (职业作家)
★
gynan123(金币+1):谢谢参与
换新鲜电泳的buffer
然后低压电泳（80V~100V）

另外，35个循环也太过分了吧……你的条带都这么浓了，无法看出差异
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3楼2009-07-01 10:53:52
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yang0071

木虫 (职业作家)
★
gynan123(金币+1):谢谢参与
1 循环数太多
2 上样量可适当减少
3 胶似乎有问题，marker都很弥散
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4楼2009-07-01 10:58:03
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zplipeng

金虫 (著名写手)
★
gynan123(金币+1):谢谢参与
非常同意楼上的说法
祝福LZ早日弄好。。。。
赞一下(1人) 回复此楼
加油哦↖(^ω^)↗，O(∩_∩)O哈哈~
5楼2009-07-01 12:07:51
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your2007

至尊木虫 (著名写手)
★
gynan123(金币+1):谢谢参与
模板加的也有点多吧，退火温度再高点
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爱人者被爱，敬人者人敬
6楼2009-07-01 12:26:24
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wangtengxu

木虫 (正式写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
1.提高退火温度
2.增加模板量，减少循环数
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想和有趣的人一起做有趣的事。
7楼2009-07-01 13:54:40
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beisimai895

木虫 (小有名气)
原来这就叫弥散，一直不知道弥散是什么现像
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8楼2009-07-01 17:04:19
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phyllislhy

木虫 (正式写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
一般用25-30个循环，模板1微升足矣。
建议用2%的琼脂糖来跑胶。
电泳的电压太大，两边的条带都弯的厉害。
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9楼2009-07-01 17:12:54
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rainbamboo8707

金虫 (小有名气)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
连marker跑的都不好，换新的缓冲液，电泳槽洗干净，减低上样量。不行的话就要优化一下反应条件了。
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10楼2009-07-01 17:23:10
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