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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 发金币求助--磷酸化蛋白检测问题
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田园1983

木虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by cauzhangtao at 2009-6-28 00:08:
我觉得用质谱法比较好，现在 的抗体应该不好弄。

如果用质谱法的话，我的蛋白是个内源蛋白，恐怕只能纯化总蛋白，怎么纯化我的目的蛋白呀？
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放下个人素质，享受缺德人生，拒绝精神内耗，有事直接发疯，与其委屈自己，不如为难别人
11楼2009-06-28 19:05:51
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lixiaolu

铁虫 (初入文坛)
★
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如果是多肽的话应该好纯化把
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我和你
12楼2009-06-28 21:07:54
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HarveyWang

捐助贵宾 (知名作家)

海外行者
★
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知道你的蛋白是什么就好办啦。

做Proteomics 2D 吧，找到两个蛋白的位置（很可能靠得很近！），
把几个可能的点（磷酸化致迁移的和没有磷酸化的）都做质谱MALDI and MALDI-PSD分析肽段，

提供以下文献，您可以在MCP期刊网站看全文：

Mass spectrometry-based methods for phosphorylation site mapping of hyperphosphorylated proteins applied to Net1, a regulator of exit from mitosis in yeast.
Loughrey Chen S, Huddleston MJ, Shou W, Deshaies RJ, Annan RS, Carr SA.
Mol Cell Proteomics. 2002 Mar;1(3):186-96


Analysis of protein phosphorylation on a proteome-scale
Mark O. Collins, Dr. *, Lu Yu, Jyoti S. Choudhary
PROTEOMICS， Volume 7 Issue 16, Pages 2751 - 2768


Proteomic analysis of tyrosine phosphorylation during human liver
transplantation
Proteome Science 2007, 5:1doi:10.1186/1477-5956-5-1
http://www.proteomesci.com/content/5/1/1


最后提示，google   phosphorylation Proteomics 你会发现更多有价值的文献。
现在的MALDI-PSD定量很成熟了。

以下是我自己的意见：
（1）你的要是用抗体来检测磷酸化程度，其一，需要这种磷酸化水平起码是对照的2倍以上，才会明显看出来。

况且，这种抗体应该是很贵的，足够你完成所有Proteomics的实验了。

（2）从蛋白质组学的角度来研究这种磷酸化位点和程度跟你的什么病症的关系，这可以发到 IF》5的期刊上去。

[ Last edited by HarveyWang on 2009-6-29 at 09:55 ]
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【我一直认为做土匪很性感很坏，很直接，可以大声喊：JCMM我爱你！所以，我自从博士毕业后，就一直在寻找黑道大哥一起去抢钱、抢粮、抢地盘】
13楼2009-06-29 09:39:03
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HarveyWang

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海外行者
引用回帖:
Originally posted by 田园1983 at 2009-6-28 19:05:


如果用质谱法的话，我的蛋白是个内源蛋白，恐怕只能纯化总蛋白，怎么纯化我的目的蛋白呀？

不用纯化！做2D ！！！
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【我一直认为做土匪很性感很坏，很直接，可以大声喊：JCMM我爱你！所以，我自从博士毕业后，就一直在寻找黑道大哥一起去抢钱、抢粮、抢地盘】
14楼2009-06-29 09:40:09
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田园1983

木虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by HarveyWang at 2009-6-29 09:39:
知道你的蛋白是什么就好办啦。

做Proteomics 2D 吧，找到两个蛋白的位置（很可能靠得很近！），
把几个可能的点（磷酸化致迁移的和没有磷酸化的）都做质谱MALDI and MALDI-PSD分析肽段，

提供以下文献，您 ...

非常感谢你的建议，对我帮助很大。虽然我的金币已经送完，不过还是衷心的谢谢你！

[ Last edited by 田园1983 on 2009-6-29 at 18:37 ]
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15楼2009-06-29 18:31:47
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HarveyWang

捐助贵宾 (知名作家)

海外行者
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给你另外一篇很有价值的文献：


Profiling the Global Tyrosine Phosphorylation State

Kazuya Machida, Bruce J. Mayer, and Peter Nollau
Mol Cell Proteomics 2003: 215–233 First Published on May 17, 2003 doi:10.1074/mcp.R300002-MCP200

Protein tyrosine kinases and protein tyrosine phosphatases play a key role in cell signaling, and the recent success of specific tyrosine kinase inhibitors in cancer treatment strongly validates the clinical relevance of basic research on tyrosine phosphorylation. Functional profiling of the tyrosine phosphoproteome is likely to lead to the identification of novel targets for drug discovery and provide a basis for novel molecular diagnostic approaches. The ultimate aim of current mass spectrometry-based phosphoproteomic approaches is the comprehensive characterization of the phosphoproteome. However, current methods are not yet sensitive enough for routine detection of a large percentage of tyrosine-phosphorylated proteins, which are generally of low abundance. In this article, we discuss alternative methods that exploit Src homology 2 (SH2) domains for profiling the tyrosine phosphoproteome. SH2 domains are small protein modules that bind specifically to tyrosine-phosphorylated peptides; there are more than 100 SH2 domains in the human genome, and different SH2 domains bind to different classes of tyrosine-phosphorylated ligands. These domains play a critical role in the propagation of signals in the cell, mediating the relocalization and complex formation of proteins in response to changes in tyrosine phosphorylation. We have developed an SH2 profiling method based on far-Western blotting, in which a battery of SH2 domains is used to probe the global state of tyrosine phosphorylation. Application to the classification of human malignancies suggests that this approach has potential as a molecular diagnostic tool. We also describe ongoing efforts to modify and improve SH2 profiling, including the development of a multiplexed assay system that will allow high-throughput functional profiling of the tyrosine phosphoproteome.
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16楼2009-06-30 21:34:18
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qingzi8575

银虫 (正式写手)

用同位素标记

★
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同位素标记的ATP磷酸化行不行
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17楼2009-07-14 10:09:21
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ly888lsp

木虫 (小有名气)
★
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如果你是跑胶得到的蛋白，可以用胰酶进行胶内酶切， 然后对酶切得到的肽段进行MS鉴定（MALDI-TOF MS 或者ESI-MS），包括一级谱，二级谱，通过相应肽段的二级谱解谱，就可以鉴定出你要的磷酸化位点。
如果你得到的蛋白在溶液中，可以进行溶液酶切，一下过程如上所述。
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18楼2009-07-14 14:00:47
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ly888lsp

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如果你是跑胶得到的蛋白，可以用胰酶进行胶内酶切， 然后对酶切得到的肽段进行MS鉴定（MALDI-TOF MS 或者ESI-MS），包括一级谱，二级谱，通过相应肽段的二级谱解谱，就可以鉴定出你要的磷酸化位点。
如果你得到的蛋白在溶液中，可以进行溶液酶切，一下过程如上所述。
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19楼2009-07-15 09:14:50
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