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田园1983木虫 (正式写手)
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[交流]
发金币求助--磷酸化蛋白检测问题
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我的实验目的： 检测病人和正常人外周血淋巴细胞中某蛋白磷酸化水平的差异 我要检测的蛋白有一个酪氨酸磷酸化位点，本来打算通过elisa和western的方法检测，但是没有查到商品化的用来测该蛋白磷酸化的kit和抗体。好像有商品化的酪氨酸磷酸化抗体，能不能用来测我的目的蛋白？如果可以的话，怎么做呢？或者有没有其他解决办法？ 从来没有做过蛋白磷酸化检测，周围人也没有了解这方面的，请虫友们多多提宝贵意见！小女子跪谢啦！ [ Last edited by 350784478 on 2009-8-5 at 20:57 ] |
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HarveyWang
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小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
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给你另外一篇很有价值的文献： Profiling the Global Tyrosine Phosphorylation State Kazuya Machida, Bruce J. Mayer, and Peter Nollau Mol Cell Proteomics 2003: 215–233 First Published on May 17, 2003 doi:10.1074/mcp.R300002-MCP200 Protein tyrosine kinases and protein tyrosine phosphatases play a key role in cell signaling, and the recent success of specific tyrosine kinase inhibitors in cancer treatment strongly validates the clinical relevance of basic research on tyrosine phosphorylation. Functional profiling of the tyrosine phosphoproteome is likely to lead to the identification of novel targets for drug discovery and provide a basis for novel molecular diagnostic approaches. The ultimate aim of current mass spectrometry-based phosphoproteomic approaches is the comprehensive characterization of the phosphoproteome. However, current methods are not yet sensitive enough for routine detection of a large percentage of tyrosine-phosphorylated proteins, which are generally of low abundance. In this article, we discuss alternative methods that exploit Src homology 2 (SH2) domains for profiling the tyrosine phosphoproteome. SH2 domains are small protein modules that bind specifically to tyrosine-phosphorylated peptides; there are more than 100 SH2 domains in the human genome, and different SH2 domains bind to different classes of tyrosine-phosphorylated ligands. These domains play a critical role in the propagation of signals in the cell, mediating the relocalization and complex formation of proteins in response to changes in tyrosine phosphorylation. We have developed an SH2 profiling method based on far-Western blotting, in which a battery of SH2 domains is used to probe the global state of tyrosine phosphorylation. Application to the classification of human malignancies suggests that this approach has potential as a molecular diagnostic tool. We also describe ongoing efforts to modify and improve SH2 profiling, including the development of a multiplexed assay system that will allow high-throughput functional profiling of the tyrosine phosphoproteome. |
16楼2009-06-30 21:34:18
yyn0452
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2楼2009-06-27 17:18:42
aaaaaa1380
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amisking(金币+3,VIP+0):哈哈，最近还真比较活跃啊|！ 6-27 22:42
田园1983(金币+10,VIP+0):非常感谢！ 6-27 22:54
amisking(金币+3,VIP+0):哈哈，最近还真比较活跃啊|！ 6-27 22:42
田园1983(金币+10,VIP+0):非常感谢！ 6-27 22:54
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强烈建议用质谱（MS）方法检测，灵敏度高，特别对氨基酸修饰检测特别合适（如果知道该蛋白质的全序列，那就最好了），因为如果发生磷酸化，相应的质谱峰m/z会发生+91 迁移。另外做质谱价格肯定比抗体Kit便宜不少。许多公司都可以做。 具体过程如下： 如果你是跑胶得到的蛋白，可以用胰酶进行胶内酶切， 然后对酶切得到的肽段进行MS鉴定（MALDI-TOF MS 或者ESI-MS），包括一级谱，二级谱，通过相应肽段的二级谱解谱，就可以鉴定出你要的磷酸化位点。 如果你得到的蛋白在溶液中，可以进行溶液酶切，一下过程如上所述。 祝实验顺利！！！  |
3楼2009-06-27 22:38:59
三磷酸腺苷
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4楼2009-06-27 22:50:24
