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guoxingjun2008

金虫 (正式写手)

[交流] PCR目的条带比较微弱?(附图)

PCR目的条带比较微弱,最有可能是哪个地方出现问题呢?我的反应体系(20ul)及条件如下:
10×buffer    2ul
F引物      0.4ul
R引物      0.4ul
dNTP            0.4ul
Taq酶       0.3ul
模版        2ul
ddH2O          14.5ul

94°预变性5min,94° 50s
                           64° 30s
                           72° 1min     
最后72°延伸10min,一共35个循环.电泳图如下,请大家帮我分析分析,谢谢!
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amilie030312

金虫 (正式写手)


小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
首先筛选退火温度,建议做梯度,找到最适合的退火温度。你那个不是目的片段微弱的问题,是说明你模板量太大了,才产生了拖带,建议你用0.5-1微升的模板量来跑,只做PCR的话25-28个循环就足够了,如果你是检测那现在的结果已经可以了,如果是要做克隆那建议你第一次PCR的模板稀释100倍然后进行二次PCR再纯化回收。
12楼2009-06-24 14:00:53
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350784478

木虫 (正式写手)


小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
可能是你的目的基因表达量低,你可以再跑一次巢式PCR,看看结果是怎么样的。
朝为田舍郎,暮登天子堂。将相本无种,男儿当自强。
2楼2009-06-22 16:07:04
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dyyyyy

铁杆木虫 (著名写手)


小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
不知道你是为了检测还是为了回收?检测就够用了。如果回收,就用pcr产物再做一次pcr,然后胶回收,目的片段
3楼2009-06-22 16:54:58
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weilin2378

木虫 (小有名气)


小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
可以试一试降低退火温度。如果还不行,可以减少模板DNA,试一下0.5微升,因为模板浓度太高也可能抑制PCR反应。
4楼2009-06-22 20:29:53
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