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| 【奖励】 本帖被评价3次，作者nancy20052008增加金币 2 个 | |||
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huvec培养心得
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用三个月的时间把huvec（人脐静脉内皮细胞）的培养技术掌握并培养成功，现在已经传代可以用来进行做下一步的实验了。 大家如果有做huvec培养的可以探讨。下面是我这段时间的小的总结，和大家分享： 人脐静脉内皮细胞（HUVEC）分离培养 方法：胶原酶灌注消化法 步骤： 1、取正常分娩4h内新生儿脐带，放入PBS中4℃保存。 2、超净台处理脐带：剪除破损、夹痕及血肿部分。 3、接在三通管上的平针头插入脐静脉用止血钳固定，冲洗脐v至无血迹。 4、脐带另一端用止血钳夹闭，向脐静脉内灌注0.1%Ⅰ型胶原酶至充盈。 5、将脐带放入预热的装有PBS的烧杯中，在37 ℃水浴锅孵育15-20min。 6、孵育完毕收集消化液和冲洗液于200ml烧杯后分装到细胞管离心。 7、1600rpm（250g）离心10分钟，弃上清，收集沉淀，PBS洗一次。 8、1600rpm（250g）离心10分钟，弃上清，向沉淀中加入细胞培养液。 9、将沉淀吹打成细胞悬液，接种到明胶预包被的细胞培养瓶中。 10、放入37 ℃、5%CO2培养箱中培养。 11、12h后换液去除未贴壁细胞，以后2-3d换液一次，汇合80%可传代培养。 这是基本的步骤，其中要注意的是脐带一定要在新生儿娩出后尽可能快的把脐带从医院取回分离脐静脉内皮细胞，超过6个小时细胞活力减少50%。 培养基的选择：我开始用的RPMI1640+VEGF+20%FBS+肝素+双抗，PH7.0，分离了30条脐带，只培养成了两次。我现在用sciencell的ECM套装，非常好用，推荐使用。 尽管有红细胞混在huvec用ECM培养基不影响内皮细胞的影响，为了消除红细胞，还是尽可能的把静脉冲洗干净。用酶消化完成后，为了脐动脉的血不会流到收集的消化液里，可以只在静脉剪开一个小口，而不剪破动脉，这样就不会有红细胞的污染。 我现在都是6个小时给细胞换液，因为都已经贴壁伸展生长了，效果也很好。 最重要的是整个实验过程中要保证无菌操作。 一点点心得，希望对做huvec培养的虫虫有帮助！ |
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2楼2009-06-17 20:17:47
3楼2009-06-18 08:28:21
5楼2009-10-27 15:05:37
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[quote]Originally posted by psfan at 2009-10-27 15:05: 很感兴趣，请教： １．PBS需要预先无菌处理吗？脐带４℃能保持多长时间？可否－３０℃冷冻长期保存？ PBS是无菌pbs，可以预先配制好后高压灭菌；保存脐带的pbs加入1%的青、链霉素双抗，防止脐带污染。脐带在4度可以保存6h，最好在4h内分离内皮细胞。－３０℃不知道能不能长期保存。 ３．“接在三通管上的平针头”是什么样的，有专门的器械么？打点滴的留滞针是否可以代替？ 平针头就是枕头顶部是平的，不是尖的，平的比较钝，就不会把脐带扎破了。打点滴用的针太细了，并且有尖，会把脐带扎破。 ４．Ⅰ型胶原酶如何制备？ Ⅰ型胶原酶：100mg胶原酶溶于100mlPBS中，溶解后0.22um滤器过滤后，4度保存备用。 ５．孵育时Ⅰ型胶原酶是否要先放出？ 孵育时Ⅰ型胶原酶要在脐带脐静脉内，不要放出，放出怎么消化内皮细胞下来呢。 6．“明胶预包被的细胞培养瓶”中的明胶是什么样的？起什么作用？ 明胶是为一种无味、无色(略带浅黄色)、半透明、坚硬的非晶态物。一般用1%的明胶包被。 1g明胶溶于100mlPBS，高压灭菌，4度保存。用前最好用0.22um滤器过滤。 明胶的作用就是使细胞更容易贴壁。 现在用的一次性的细胞培养瓶，不用包被的。 |
6楼2009-12-07 22:28:45
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yqhc4楼
2009-06-18 11:54
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