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huvec培养心得
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用三个月的时间把huvec（人脐静脉内皮细胞）的培养技术掌握并培养成功，现在已经传代可以用来进行做下一步的实验了。 大家如果有做huvec培养的可以探讨。下面是我这段时间的小的总结，和大家分享： 人脐静脉内皮细胞（HUVEC）分离培养 方法：胶原酶灌注消化法 步骤： 1、取正常分娩4h内新生儿脐带，放入PBS中4℃保存。 2、超净台处理脐带：剪除破损、夹痕及血肿部分。 3、接在三通管上的平针头插入脐静脉用止血钳固定，冲洗脐v至无血迹。 4、脐带另一端用止血钳夹闭，向脐静脉内灌注0.1%Ⅰ型胶原酶至充盈。 5、将脐带放入预热的装有PBS的烧杯中，在37 ℃水浴锅孵育15-20min。 6、孵育完毕收集消化液和冲洗液于200ml烧杯后分装到细胞管离心。 7、1600rpm（250g）离心10分钟，弃上清，收集沉淀，PBS洗一次。 8、1600rpm（250g）离心10分钟，弃上清，向沉淀中加入细胞培养液。 9、将沉淀吹打成细胞悬液，接种到明胶预包被的细胞培养瓶中。 10、放入37 ℃、5%CO2培养箱中培养。 11、12h后换液去除未贴壁细胞，以后2-3d换液一次，汇合80%可传代培养。 这是基本的步骤，其中要注意的是脐带一定要在新生儿娩出后尽可能快的把脐带从医院取回分离脐静脉内皮细胞，超过6个小时细胞活力减少50%。 培养基的选择：我开始用的RPMI1640+VEGF+20%FBS+肝素+双抗，PH7.0，分离了30条脐带，只培养成了两次。我现在用sciencell的ECM套装，非常好用，推荐使用。 尽管有红细胞混在huvec用ECM培养基不影响内皮细胞的影响，为了消除红细胞，还是尽可能的把静脉冲洗干净。用酶消化完成后，为了脐动脉的血不会流到收集的消化液里，可以只在静脉剪开一个小口，而不剪破动脉，这样就不会有红细胞的污染。 我现在都是6个小时给细胞换液，因为都已经贴壁伸展生长了，效果也很好。 最重要的是整个实验过程中要保证无菌操作。 一点点心得，希望对做huvec培养的虫虫有帮助！ |
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