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vince8181

木虫 (正式写手)

应助: 0 (幼儿园)
金币: 1945.5
散金: 100
帖子: 760
在线: 200.1小时
虫号: 359924
注册: 2007-04-29
性别: GG
专业: 细胞信号转导

[交流] 关于real time标准曲线的制作

近期想做real time PCR，是关于基因差异表达的，我只需要知道两个样本中目的基因的表达差异就够了，从现在了解的知识是，可以用双标准曲线法和2-ΔΔCt法，但是无论哪种方法都要做标准曲线，后者要验证目的基因和管家基因的扩增效率，只有扩增效率相差不大，才能用这个方法，可是做标准曲线需要制作标准品，好像是质粒，可是我从来没接触过这方面的知识，更别说制作了，我就想知道：可不可以用我的cDNA模版进行梯度稀释分别对目的基因和管家基因进行扩增来做标准曲线？如果不行，还有什么更简便的方法呢？

另外，相关的耗材我买了axygen的八排管，125排那种，也买了axygen 1000个袋装0.2ml的PCR管（分装试剂和引物），还买了axygen盒装枪头若干及200ul及10ul 袋装枪头各一包，听说Axygen的东西都是RNase，Dnase free的，可网上查了一下，有的人说还是要高压消毒一下比较好，也不知道哪个对，有用过的虫友不吝赐教啊。

[ Last edited by vince8181 on 2009-6-13 at 19:45 ]

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1楼 2009-06-13 19:43:47

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sutao1979

木虫 (著名写手)

小木虫10年groupleader

BioEPI: 1
应助: 5 (幼儿园)
贵宾: 0.694
金币: 3553.3
散金: 150
红花: 3
帖子: 1479
在线: 64小时
虫号: 79951
注册: 2005-07-12
性别: GG
专业: 植物分类学

★ ★ ★ ★ ★ ★
amisking(金币+3,VIP+0):很强大！ 6-13 23:18
vince8181(金币+2,VIP+0): 6-13 23:43
vince8181(金币+1,VIP+0):谢谢你的回复，你是说每次做都要用样品混合物啊，为什么不用单个样品来做标准曲线呢？ 6-13 23:53

axygen是进口的不需要灭菌
标准曲线通常使用cDNAmix（也可以用标准品），就是你的样品的混合物，然后进行梯度稀释（这个稀释主要看你模板的浓度而定），每次做待测基因都要一起做参考基因（管家基因），尽量做到两者的扩增效率差不多，然后让待测基因和参考基因进行比值（双标准曲线法）